肝细胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在世界上居恶性肿瘤的第五位，而在我国则占据恶性肿瘤死亡率的第二位。外科手术切除，热消融和肝移植是目前肝癌根治性治疗的主要手段，其中以手术切除为金标准。但是，超过70％的患者在初次就诊时因肿瘤进展或肝功能不全而无法接受手术治疗，而且手术后复发率高，复发后再切除机会低，外科治疗的应用受到严重限制。热消融具有创伤小、并发症少、可反复多次进行等优点，已经成为部分不可手术或者不宜手术治疗的肝癌及术后复发的主要治疗手段。但是肝癌行消融治疗后复发率仍较高，因此，如何降低消融术后的复发率是提高消融治疗效果的关键。　　 机体对肿瘤不能产生有效的免疫反应是肿瘤转移和复发的最主要原因。抗肿瘤免疫需要肿瘤抗原、抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APCs)和效应细胞的参与。既往研究发现消融后局部可以产生大量的肿瘤抗原，机体产生强大的、可抑制肿瘤进展的免疫效应。既往研究还发现，局部高浓度的细胞因子能够显著放大已产生的抗肿瘤免疫。将大剂量的生物活性细胞因子(IL-2，IL-12等)注入小鼠活体瘤内，结果产生了保护性免疫，显著抑制了肿瘤生长。我们已经成功地建立含有小剂量白介素-2(interleukin-2，IL-2)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)的缓释微球。以此作为免疫激活剂，可以刺激机体产生更强大的免疫效应。在前期研究基础上，我们建立了皮下肝癌模型，在微波消融治疗的基础上应用免疫激活剂，以观察其对机体免疫效应的影响。　　 第一部分建立小鼠皮下移植型肝癌消融模型　　 材料和方法:　　 1.小鼠皮下移植型肝癌模型的建立：常规体外培养小鼠Hepa1-6肝癌细胞，按接种细胞数量不同对小鼠分组。于C57BL/6J小鼠右侧胁腰部皮下接种Hepa1-6细胞，建立小鼠皮下移植型肝癌模型，观察成瘤率，筛选出建立消融的模型最佳细胞数量。切除皮下移植瘤体做病理检查。　　 2.将最佳数量细胞注射在C57BL/6J小鼠右侧胁腰部，观察皮下肿瘤生长。绘制小鼠皮下移植瘤的生长曲线，建立适合消融的小鼠皮下移植肝癌模型。　　 3.运用已建立C57BL/6J小鼠Hepa1-6细胞皮下移植肝癌模型，观察不同消融时间与瘤内温度或瘤缘温度的关系，以及不同消融条件下行微波消融后小鼠皮下肝癌移植瘤的30d残瘤率。　　 结果:　　 1.皮下注射小鼠Hepa1-6肝癌细胞建立小鼠皮下移植型肝癌模型，适合消融的接种细胞数量最佳选择为2×106。　　 2.接种Hepa1-6细胞后第10 d，小鼠皮下肝癌长径达到6-8 mm，达到消融的要求。　　 3.随消融时间延长，瘤内及瘤缘温度升高，55℃3min的消融条件能有效灭活小鼠的皮下移植瘤。病理检查提示消融后肿瘤组织呈坏死干痂样物，镜下未见活的癌细胞。消融后肿瘤结节在第八周内完全消退。　　 结论:　　 1、建立了小鼠皮下肝癌消融模型　　 2、初步掌握了皮下肝癌的最佳消融条件。　　 第二部分免疫激活剂对热消融后淋巴细胞增殖的刺激作用　　 材料和方法:　　 1.设立两个对照组：微波消融( MWA)后瘤内注射PBS组和MWA后瘤内注射CytoMPS组，按照第一部分条件建立皮下肝癌消融模型。　　 2.制备细胞因子缓释微球( CytoMPS)，消融后第3、7、10天瘤内注射CytoMPS。　　 3.流式细胞仪检测外周血淋巴细胞变化：CytoMPS第三次注射后3天后处死小鼠，摘除眼球，经眼动脉取血，肝素抗凝处理，1小时内送流式细胞仪检测，计算外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞变化。　　 结果:　　 MWA后原位注射CytoMPS组血液中的CD4+、CD8+T淋巴细胞明显高于MWA后注射PBS组(P<0.001)。　　 结论:　　 MWA后应用免疫激活剂(CytoMPS)对外周血的淋巴细胞增殖有明显的刺激作用。　　 第三部分免疫激活剂对热消融后淋巴细胞功能的增强作用　　 材料和方法　　 1.设立两个对照组：MWA后注射PBS组和MWA-ISV组，按照第一部分条件建立皮下肝癌消融模型。　　 2.制备细胞因子缓释微球(CytoMPS)，进行消融后第3、7、10天瘤内注射CytoMPS。　　 3.疫苗诱导体外CTL的杀瘤活性检测：CytoMPS第三次注射后3天后处死小鼠，无菌取小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，培养7天，LDH释放法测定CTL的杀瘤活性，靶细胞为Hepal-6细胞，效应细胞与靶细胞的比例为20:1。　　 结果:　　 淋巴细胞杀伤实验结果显示瘤内注射CytoMPS组的脾CTL对靶细胞的杀伤率明显高于注射PBS组(P<0.001)。　　 结论:　　 免疫激活剂能显著增强机体产生的以CTL细胞为主的抗肿瘤免疫效应。