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柑橘黄龙病(HLB)是影响全球柑橘产业发展的最严重病害之一。目前该细菌尚无法获得离体纯培养,严重阻碍了其生物学特性、遗传变异和致病分子机制的研究。HLB菌全基因组序列的公布,为其致病机制研究提供了理论参考。在本研究中,为了探讨CLas致病的可能分子机制,我们对假定致病相关效应子基因在不同症状样本中的表达水平,以及柑橘中部分防卫相关基因进行了表达特性分析。另外对巴基斯坦样品中的黄龙病菌进行基于Cthr基因的遗传多样性分析。同时对利用菟丝子从柑橘向长春花和烟草传播CLas进行了研究,获得的主要结果如下:1.致病相关效应子基因表达分析:我们从中国主要的柑橘产区,包括江西、云南、海南等地,收集了表现不同症状的样品。运用q RT-PCR分析了9个效应子基因在均匀黄化(Y)、斑驳黄化(BM)、脉凸(VK)和缺锌黄化(ZD)症状中的表达特性。结果如下:CLas03230、CLas04025和CLas04560在VK症状中表达水平较高,而CLas02075、CLas02145、CLas00530和CLas05320表达水平较低。在ZD症状样品中,CLas03230,CLas4560,and RS03120表达水平较高,CLas02075and CLas05320的表达水平相对较低。在BM症状的样品中,CLas04560的表达量最高,CLas02145,CLas00530,CLas05320,CLas03230,CLas5315,CLas04025的表达量相对较低。CLas05315在黄化症状中表达水平较最高,而CLas03230、CLas04560、RS03120表达水平相对较低。柑橘中防卫相关基因RTPCR表达分析显示:HSP,Drle1基因在VK,ZD,BM and Y表达水平较高;而CSSP基因在VK,BM and Y症状的样品中表达水平相对较高,但是在ZD样品中的表达量相对较低。2.基于Cthr基因的巴基斯坦样品的遗传多样性分析:首先对来自哈内瓦尔的19个样品进行了Cthr基因扩增、鉴定,对阳性样品的目标基因进行了克隆和测序分析。结果表明:Cthr基因在不同分离物中扩增条带差异较大,有单一条带和多条带之分。其中,5个分离物扩增条带表现为单一条带,7个分离物的扩增条带表现为为双条带,1个分离物表现为三条带。条带序列大小介于950bp-1800bp之间。在甜橙4.2和4.3分离物中分别获得了1566 bp和1374 bp的单一带型。在Kinnow-5分离物中得到了1614bp和1619 bp两种带型。而在Kinnow-1分离物中获得了1517 bp、1770 bp和1518 bp三种带型。经系统进化分析,Kinnow-23分离物与中国广西分离物Gxpsy和佛罗里达分离物UF0506的相似度均较高,其余分离物与中国广东分离物A4相似度较高,而与佛罗里达分离物SC2没有明显的相似性。3.菟丝子传播黄龙病菌研究:将健康长春花、烟草种子分别播种在含有灭菌土的苗钵中。菟丝子(Cuscuta indecora)种子在长春花和烟草发芽一周后进行播种。待菟丝子卷须长至7-10 cm左右,置于感染黄龙病菌的甜橙枝条上,20 d后建立稳固的寄生关系,再将卷须尖端缠绕到健康长春花和烟草实生苗上,进行CLas传播。结果表明:菟丝子分别在6 d和15 d开始在长春花和烟草上形成吸器。长春花在35 dpi时出现黄化症状,而N.tabacum cv.Xanthi和N.tabacum cv.Hongda烟草上直到6个月后才出现较轻微的斑驳症状。为了进一步证明长春花和烟草中感染了CLas,我们在不同的时间点从N.tabacum cv.Xanthi,N.tabacum cv.Hongda,C.roseus采集样品提取g DNA,运用CLas 16s r DNA特异引物进行PCR检测分析,结果显示:在菟丝子与长春花建立寄生关系后40 d可在长春花样品中检测到强阳性信号。与长春花样品相比,N.tabacum cv.Xanthi和N.tabacum cv.Hongda的中的阳性条带较弱。本研究成功利用菟丝子将CLas从柑橘传播至长春花和烟草中,长春花较烟草更易被感染,症状表现更早,为后续致病性研究奠定了坚实基础。