由春雷链霉菌(Streptomyces kasugaensis)产生的春雷霉素属于一种重要的氨基糖苷类抗生素,在农业病害防治方面发挥着不可忽视的作用。早期有关春雷霉素生物合成途径的研究进展非常缓慢,对春雷链霉菌的研究大多集中在传统的发酵工艺优化及传统诱变育种技术的改进方面。这些改造技术对提升高产菌株合成春雷霉素能力的空间是有限的。春雷霉素生物合成基因簇于2006年第一次被报道,2016年研究者们在春雷霉素生物合成基因簇的上游又找到了几个相关的调控基因,并对调控基因进行了功能鉴定。在初期的研究工作中我们尝试利用以载体p JTU1278为基础构建了同源臂敲除载体,并成功敲除两个未知功能基因kas B和kas I。通过对突变菌株的发酵液分析我们发现:kas B基因的缺失导致春雷霉素生物合成的终止,而kas I基因的缺失对春雷霉素产量没有明显影响。说明kas B基因与春雷霉素的合成有关,kas I基因与春雷霉素的生物合成没有直接关系。在利用同源重组方法敲除基因的研究工作中发现,利用同源臂敲除的方法在春雷霉素产生菌中获得突变株的效率很低,我们期望通过构建春雷链霉菌基因组文库为将来的研究工作提供便利。本研究后期的工作中成功建立了小金色链霉菌基因组cosmid文库,其包含3360个克隆,平均插入片段大小为30kb左右,覆盖基因组11.2倍。文库的建立将为以后利用PCR-targetting系统敲除基因的工作奠定实验基础,从而有利于春雷链霉菌进一步的遗传改造工作。从构建的基因组文库中我们成功钓取到2个含有春雷霉素生物合成基因簇的cosmid15F10和26B1。利用15F10质粒我们构建了春雷霉素基因簇缺失菌株;通过接合转移将春雷霉素合成基因簇转移至春雷霉素基因簇缺失菌株中可以大大加速我们研究春雷霉素的生物合成途径。为了对高产菌株进行进一步的高产改造,本研究中我们尝试通过增加生物合成过程中关键基因拷贝数和加倍完整基因簇两种策略,构建了kas E基因加倍突变株和春雷霉素生物合成基因簇加倍突变株。很遗憾的是这两种改造策略并没有如预期所想地一样提高高产菌株合成春雷霉素的能力。在本研究后期的工作中,基于RNA-seq的比较转录组分析发现:高产菌株中高表达的关键酶包括糖酵解过程中的磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶、戊糖磷酸途径的氧化阶段的磷酸葡萄糖内酯酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶、脂肪酸合成途径中的关键限速酶乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸降解途径中的乙醛脱氢酶和烯酰辅酶A水合酶。本研究更进一步地从春雷霉素前体合成途径寻找到影响春雷霉素合成的关键酶磷酸肌醇合成酶contig2＿522。这些关键酶的发现将有助于我们未来通过体内实验研究这些关键酶对春雷霉素高产的贡献并解析春雷霉素的高产机制,为将来对春雷霉素高产菌株的改造提供了理论基础。