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Plantaricin NC8是Class Ⅱb类乳酸菌细菌素,由位于同一个操纵子的两个基因编码的寡肽PLNC8α和PLNC8β组成,可利用两条寡肽的协同作用抑制多种细菌,是潜在的天然食品防腐剂和抗生素替代品。其天然合成所需的共培养自诱导机制非常复杂,天然产物分离纯化困难,得率较低,不利于后期市场应用。另外,Plantaricin NC8的抗菌谱和杀菌机制研究尚处空白。因此,本研究首先利用生物信息学方法分析该乳酸菌细菌素的理化性质和结构特征,推测结构和功能的关系,然后通过固相合成法合成Plantaricin NC8,研究PLNC8α和PLNC8β产生的协同抑菌作用,并获得Plantaricin NC8的抗菌谱,进而探索Plantaricin NC8杀死革兰氏阴性菌肠炎沙门氏菌的机制,并构建了高效产Plantaricin NC8的基因工程菌,为其今后市场开发利用奠定坚实的理论基础。主要内容如下:1.Plantaricin NC8的生物信息学分析PLNC8α和PLNC8β都由常见氨基酸组成,为阳离子肽,等电点呈碱性,具有较好的两亲性。经空间结构预测,PLNC8α具有与nmda receptor nr1跨膜区域transmembrane segment 2和磷脂双分子层转运蛋白相类似的空间结构。而PLNC8β与同为Class Ⅱb类细菌素的Plantaricin JK中的寡肽PLNJ具有相似的空间结构。2.Plantaricin NC8的抗菌谱制作和协同作用研究利用固相合成法合成纯度大于98%的PLNC8α和PLNC8β。通过抑菌活性和最小抑菌浓度实验,获得Plantaricin NC8的抗菌谱,发现其可以抑制多种革兰氏阴/阳性菌和部分真菌,尤其对革兰氏阴性菌Salmonella spp.有较好的抑制作用。此外,PLNC8β单独存在时的抗菌活性比PLNC8α强,而两条寡肽以摩尔比1:1混合成的Plantaricin NC8的抗菌活性比PLNC8α或PLNC8β单独存在时都强。故可初步证明,Plantaricin NC8存在一定的协同抗菌作用。3.Plantaricin NC8的膜渗透杀菌机制研究以常见食源性致病菌肠炎沙门氏菌CGMCC1.1552作为指示菌,经Plantaricin NC8处理过的肠炎沙门氏菌CGMCC1.1552跨膜电势差(Δψ)和质子浓度梯度(ΔpH)瞬间坍塌,胞内ATP水平迅速消失,胞外电导率急剧升高,说明指示菌的质子电动势(PMF)已坍塌。结合扫描电镜和透射电镜观察,发现经Plantaricin NC8处理过的指示菌细胞表面和剖面形态结构均有显著变化。综上所述,Plantaricin NC8诱导指示菌细胞膜通透性增加,胞内离子泄露,致使指示菌细胞膜破损,内容物外泄,最终导致其死亡。4.Plantaricin NC8与Lipid Ⅱ的结合作用研究合成细菌素常见靶标—细胞壁前体分子Lipid Ⅱ。以肠炎沙门氏菌CGMCC1.1552为指示菌,采用荧光泄漏试验检测只加入Plantaricin NC8或同时加入Plantaricin NC8以及过量的Lipid Ⅱ,指示菌细胞膜荧光探针DiSC2(5)的响应值变化,以此推断Plantaricin NC8和Lipid Ⅱ的结合情况。结果表明,外在添加过量的Lipid Ⅱ并没有与指示菌内在的Lipid Ⅱ 竞争性结合 Plantaricin NC8,因此 Plantaricin NC8 的作用靶标不是常见的细菌素作用靶标Lipid Ⅱ。5.Plantaricin NC8与指示菌基因组DNA结合杀菌机制研究由凝胶阻滞实验可以发现,Plantaricin NC8与肠炎沙门氏菌CGMCC1.1552基因组DNA结合强烈,导致复合分子增大,使得电泳时DNA向正极的运动速度变得缓慢,迁移率下降,但电泳后的DNA条带始终保持完整,并未出现拖带,说明细菌素在作用过程中没有引起肠炎沙门氏菌CGMCC1.1552基因组DNA的断裂。随着细菌素浓度的增加,细菌素和指示菌基因组DNA的结合已使EB染料无法插入DNA碱基对中,使得DNA没有发出荧光,即没有条带。因此,Plantaricin NC8可与指示菌基因组DNA结合,作用方式可能包括与EB类似的核酸嵌入作用,与EB竞争性插入DNA碱基中。另外,Plantaricin NC8与细菌基因组DNA结合的紫外光谱分析表明它们可以和细菌基因组DNA结合并插入DNA结构中,使得DNA在紫外区的特征吸收峰降低,产生减色效应。由此总结,Plantaricin NC8以指示菌细胞膜和基因组DNA为“双靶标,”杀菌,即“膜渗透”和“结合基因组DNA”,但细菌素常见靶标物质LipidⅡ 并非 Plantaricin NC8 的靶目标。6.细菌素基因异源高效表达研究PLNC8α和PLNC8β通过基因工程手段成功在E.coli BL21(DE3)中实现异源表达,形成带His标签的融合蛋白。经过Plackett-Burman试验和响应面优化后,Trx-(His)6-PLNC8α可溶性融合蛋白产量从优化前的每升培养基产4 mg提升到23.04±0.92 mg。Trx-(His)6-PLNC8β可溶性融合蛋白产量从优化前的每升培养基产4 mg提升到18.30±0.80 mg。再经镍柱纯化和肠激酶酶切分离纯化后,得到的PLNC8α的产量为2-2.5 mg/L,PLNC8β 的产量在 1.5-2 mg/L。经 Tricine-SDS-PAGE 和MALDI-TOF-MS鉴定,多肽的条带大小和分子量大小均与理论值相符。经抗菌活性试验可知,异源表达的Plantaricin NC8活性好,仍存在协同抗菌作用,且比固相合成的Plantaricin NC8在培养基中的逸散效果更好。这一研究为今后利用食品级乳酸菌基因工程菌异源表达Plantaricin NC8奠定基础。异源表达的Plantaricin NC8成本更低,可大量生产,若能进一步优化分离纯化方法,将有良好的市场应用前景。