论文部分内容阅读
肺癌的侵袭及淋巴结转移过程,至少有五类因子参与：运动因子、粘附因子、趋化因子、细胞外基质降解酶、血管淋巴管形成因子。CCR7与其配体CCL21属于趋化因子(chemokine),趋化的主要归宿是次级淋巴组织,VEGF-C是最有效的促淋巴管生长因子,MMPs是最有效的细胞外基质降解酶,这三者之间在肺癌的淋巴结转移中是否具有网络相互作用,值得探索研究。本实验首先应用免疫组化技术研究CCR7和VEGF-C在非小细胞肺癌中的表达状况,以及与微淋巴管生成、肿瘤淋巴结转移之间的相关性；在此基础上通过transwell小室培养实验及定量RT-PCR、Western blot方法,分别从mRNA、蛋白表达两个方面,研究CCR7/CCL21对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭能力和转移相关因子表达的影响。初步探讨CCR7/CCL21轴在调节非小细胞肺癌恶性生物学特征中的作用机制。实验从以下三个方面进行了研究：第一部分：CCR7与VEGF-C在非小细胞肺癌中的表达与临床病理的关系目的：采用免疫组化的方法研究CCR7与VEGF-C在肺癌组织及癌旁组织的表达情况以及检测癌组织癌旁组织的淋巴管密度,统计并分析非小细胞肺癌患者的CCR7与VEGF-C的表达与临床病理参数的相关性,及其与淋巴管新生、淋巴结转移的关系。方法：1、收集临床病理证实为非小细胞肺癌的病理石蜡块60例,利用免疫组化方法检测CCR7及VEGF-C在癌组织、癌旁组织的表达定位和表达量,分析其表达水平与患者年龄、性别、癌灶大小、组织学分型、肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期以及淋巴结转移的相关性。2、利用免疫组化方法检测癌组织、癌旁组织中新生微毛细淋巴管的密度(MLVD),研究CCR7及VEGF-C在肺癌组织、癌旁组织中的表达与新生毛细淋巴管生成的相关性,以及新生淋巴管密度与淋巴结转移的相关性。结果：1、CCR7及VEGF-C皆表达在肺癌细胞的胞浆及胞膜部位,CCR7阳性表达率66.7%,其中低表达23例,高表达17例。癌旁组织中,CCR7阳性表达率56.7%,其中高表达25例,低表达9例。CCR7在癌组织的表达高于在癌旁组织的表达。二者有统计学意义(P=0.007)。2、VEGF-C在癌组织阳性表达率76.7%,其中低表达14例,高表达32例,癌旁组织中,VEGF-C阳性表达率38.3%,其中低表达13例,高表达10例。VEGF-C在癌组织的表达高于癌旁组织。其表达水平差异有统计学意义(P=0.036)。3、D2-40标记的微淋巴管在癌组织、癌旁组织的平均密度分别为(15.62±9.64)、(16.94±9.31),两者无统计学差异(P=0.047),但淋巴结转移组的癌组织、癌旁组织的微淋巴管密度(24.38±9.01)、(23.06±9.26)均明显高于无淋巴结转移组的淋巴管密度(9.79±3.96)、(12.87±6.84),表达水平差异有统计学意义(P=0.000)。将肿瘤按照病理类型进行分组后,腺癌及鳞癌的淋巴管密度无统计学差异(P=0.923)。4、CCR7在肺癌组织中的表达水平与患者年龄(P=0.357)、性别(P=0.05)、癌灶大小(P=0.361)、组织学分型(P=0.453)和肿瘤分化程度(P=0.92)无统计学差异,与淋巴结转移及肿瘤分期具有统计学差异(P=0.005)。5、VEGF-C在肺癌组织中的表达水平与患者年龄(P=0.967)、性别(P=0.347)、癌灶大小(P=0.640)、组织学分型(P=0.691)和肿瘤分化程度(P=0.103)无统计学差异,与肿瘤分期(P=0.025)及淋巴结是否转移(P=0.026)具有统计学差异。6、CCR7的表达水平与非小细胞肺癌的新生微淋巴管密度呈正相关。7、CCR7在癌组织及癌旁组织的表达水平与VEGF-C在癌组织癌旁组织中的表达呈正相关,相关性较弱(r=0.29：r=0.263)。结论：CCR7及VEGF-C在非小细胞肺癌及癌旁组织中均有表达,CCR7的表达水平与非小细胞肺癌新生微淋巴管密度具有正相关性,与淋巴结转移以及肿瘤的临床分期具有相关性,提示CCR7可能参与肿瘤淋巴管的形成及淋巴结转移。第二部分：CCR7/CCL21轴对A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响目的：通过体外细胞实验,研究A549细胞经过趋化因子CCL21刺激后,肺癌细胞增殖及侵袭能力的变化,进而了解CCR7/CCL21轴对肺癌恶性生物学特性的影响。方法：1、利用MTT(噻唑兰比色分析法)分别测定A549细胞增殖曲线以及加入不同浓度CCL21后的细胞增殖曲线,观察趋化因子对细胞增殖活性的影响；2、利用transwell小室,进行细胞迁移实验及Matrigel侵袭实验,研究CCR7/CCL21轴对A549细胞的体外迁移及侵袭能力的影响。结果：1、经过CCL21刺激趋化作用后,A549细胞的增殖活性明显增强：在CCL21为100ng/ml时,细胞增殖能力最强。2、经过CCL21刺激后,A549细胞的迁移及侵袭能力增强。结论：CCR7/CCL21轴具有增强A549细胞增殖以及迁移、侵袭能力的作用,当CCL21浓度为100ng/ml时,对A549细胞的增殖活性影响最强。第三部分：CCR7/CCL21对转移相关因子VEGF-C及MMP9的影响目的：通过定量RT-PCR技术和Western blot方法观察CCR7/CCL21轴对A549细胞转移相关因子VEGF-C及MMP9的基因转录水平和蛋白表达的影响。方法：设计VEGF-C及MMP9的PCR引物,利用定量RT-PCR技术对A549细胞以及经CCL21活化的A549细胞中的VEGF-C和MMP9基因进行扩增,研究CCL21的活化对VEGF-C mRNA和MMP9mRNA表达作用。进一步采用Western blot方法研究CCL21对VEGF-C及MMP9蛋白表达的影响。结果：通过CCL21的活化,A549细胞中VEGF-C及MMP9的mRNA表达明显增多,且具有一定的时间效应,同时,CCL21还可增加VEGF-C及MMP9蛋白的表达。结论：CCR7/CCL21轴能够调控调控肿瘤细胞VEGF-C及MMP9的mRNA及蛋白表达,进而可能通过影响肿瘤的侵袭能力及淋巴管形成能力。促使淋巴结远处转移能力增强。