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进入二十一世纪,化肥和农药滥施对我国土地资源破坏严重且带来了一系列食品安全问题。植物促生菌肥即植物根际促生细菌（plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR）制成的生物制剂,PGPR主要包括固氮根瘤菌、溶磷或解钾菌、其他生防菌类等,可在作物根系或根际土壤中定殖存活,从而促进作物生长发育或抑制周围环境中病原菌的生长。PGPR作为一种微生物肥料,在发展绿色农业上应用前景广阔。然而,PGPR菌肥在实际应用中的促生效果并不稳定,实验室肥效显著,大田施用后效果并不稳定,会因地块地理位置、土壤营养状况、作物品种及施用年份不同受到影响,因此开展高效PGPR菌株选育及其促生机理的研究具有十分重要的意义。PGPR能否有效发挥作用,主要决定于能否和作物根际其他土著微生物群落竞争取胜,从而在作物根部或根际土壤中稳定生长繁殖。PGPR可感知作物根际环境中根系分泌物的浓度变化,借助趋化作用到达植株根际并在根际形成稳定的菌膜结构。趋化性是指细菌感知周围环境中化学物质的浓度梯度后借助鞭毛等运动器官所作出的趋向引诱剂或远离排斥物的反应。将PGPR与趋化作用相关的基因敲除后,PGPR在作物根际的生存繁殖能力显著下降,大量研究表明PGPR在作物根际的定殖数量直接影响其对作物的促生效果。通过本课题研究我们尝试找出促使PGPR向作物根际定殖的关键趋化物质,同时开展高效PGPR菌株选育,以期稳定和提高PGPR的大田施用效果,主要研究成果如下:1、ACC是恶臭假单胞菌UW4的强趋化物采用平板点滴趋化分析方法,将UW4对ACC、植物根系分泌物中常见的其他8种氨基酸以及7种有机酸的趋化响应强度进行了对比,结果发现:精氨酸和琥珀酸对于UW4是强趋化物,然而,UW4对ACC的趋化强度要显著高于这二者。毛细管趋化法定量测定了UW4对ACC、精氨酸和琥珀酸趋化响应阈值及峰值浓度,发现UW4对ACC的趋化阈值为5×10-5M,峰值浓度为5×10-2M,其趋化响应强度高于精氨酸及琥珀酸。同时用定量毛细管趋化法比较了UW4对ACC和人工模拟根系分泌物（artificial root exudate,ARE）的趋化能力,试验结果发现:UW4对ACC的趋化响应最强,对ACC和ARE混合物趋化较弱,对ARE趋化最弱,表明ACC是UW4的强趋化物。2、ACC应是恶臭假单胞菌UW4向作物根际和真菌菌丝定殖的关键趋化物将UW4、UW4△AcdS及构建的cheR基因缺失突变及回补菌株与双孢蘑菇进行共培养,测得UW4及UW4△cheR+cheR菌株在真菌菌丝表面的定殖数量较多,而UW4△AcdS和UW4△cheR菌株数量较少（p＜0.05）。双孢蘑菇（Agaricus bisporus）具有和植物相同的乙烯合成途径,菌丝分泌物中也含有ACC。采用组培瓶栽小麦的方法测定了各菌株在小麦根际的定殖情况与双孢蘑菇相似。将上述菌株接种至小麦种子进行盆栽实验,结果发现:UW4和UW4△AcdS和UW4△cheR+cheR处理的小麦根长、根重、茎长、茎重均显著高于UW4 △AcdS和UW4 △cheR（p ＜0.05）。表明ACC应是恶臭假单胞菌UW4向作物根际和真菌菌丝定殖的关键趋化物。3、提高恶臭假单胞菌UW4对ACC的代谢速率增强其对ACC的趋化响应强度和根际定殖量提高对代谢依赖型趋化物的代谢速率是否能够增强细菌的趋化响应强度尚未见报道。我们采用同源重组技术将细菌组成型强启动子PB20序列无痕敲入UW4的AcdS基因的上游,成功构建了 ACC脱氨酶高效表达菌株UW4-PBA。采用荧光定量PCR测定UW4-PBA菌株AcdS基因表达量,在未加入ACC时是对照的约30倍,加入ACC诱导45min后上升至约81倍,其AcdS基因表达量与ACC诱导后的UW4的表达量间无显著性差异（p＜0.05）。此外,UW4-PBA菌株的ACC脱氨酶活力比UW4高约6μmoL/(μg·min,且数据间差异显著（p＜0.05）。定性趋化结果显示,UW4-PBA对ACC、γ-氨基丁酸、精氨酸及琥珀酸的趋化圈直径明显大于UW4,且数据间有显著性差异（p＜0.05）。将其与本课题组成员前期构建的带有强中弱启动子PB20、PB10、PB1及UW4AcdS基因自身启动子的 UW4 △AcdS+PB20-AcdS、UW4△AcdS+PB10-AcdS、UW4△AcdS+PB1-AcdS、UW4△AcdS+PA-AcdS菌株、野生株UW4及UW4△AcdS接种至小麦根际,无菌瓶栽实验结果显示,UW4-PBA菌株在小麦根际的定殖数量最多,UW4△AcdS+PB1-AcdS及UW4△AcdS菌株定殖数量则较少,各数据间存在显著性差异（p＜0.05）;将上述菌株接种小麦种子后进行盆栽（非无菌条件）,实验发现:UW4-PBA菌株在盆栽小麦根际定殖数量显著高于其他6个菌株（p＜0.05）,UW4 △AcdS+PB20-AcdS和UW4-PBA处理的小麦根长显著高于其他菌株,UW4 △Acds+PB20-AcdS、UW4-PBA和UW4菌株处理后的小麦根重显著高于其他几个菌株,UW4 △AcdS+PB20-AcdS、UW4-PBA菌株处理后的小麦茎重也显著高于其他几个菌株（p＜0.05）。综上所述,提高对ACC的代谢速率能够显著增强UW4对ACC的趋化响应强度及向根际趋化的能力,这一结果更证实ACC确是UW4向作物根系或根际土壤趋化定殖的关键趋化物。4、恶臭假单胞菌UW4的ACC趋化受体的鉴定采用荧光定量PCR测定了 UW4中28种拟趋化受体蛋白的表达情况,筛选出了 ACC诱导下高表达的四个候选拟趋化受体蛋白分别为wp116、wp375、wp616和wp718;分别构建出这四个拟趋化受体基因的敲除突变株及回补株,平板点滴趋化实验发现:与野生株UW4相比,UW4△wp116完全丧失了对ACC、γ-氨基丁酸和精氨酸的趋化,但对琥珀酸的趋化基本未受影响,UW4△wp116+wp116则恢复了对 ACC、γ-氨基丁酸和精氨酸的趋化作用,UW4△wp375、UW4△wp616、UW4△wp718 对 ACC、γ-氨基丁酸、精氨酸及琥珀酸的趋化强度有一定影响但并未造成趋化丧失,因此推断wp116可能是ACC的趋化受体,但并非特异性受体,ACC与部分蛋白质类氨基酸的趋化受体可能同为wp116。将wp116的配体结合结构域在大肠杆菌中表达并纯化,应用荧光热漂移分析发现,该配体结合结构域与ACC亲和力最强,据此推测wp116应为ACC的趋化受体。1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC）是植物根际分泌物的重要成分,是否是细菌的趋化物尚未见报道。通过本研究我们发现,UW4能够趋化ACC,而其ACC脱氨酶（ACC deaminase,AcdS）基因缺失突变株 UW4 △AcdS和趋化蛋白甲基转移酶（chemotaxis protein methyltrans-ferase,CheR）基因缺失突变株UW4 △cheR则不趋化ACC。与其他趋化物质相比UW4对ACC的趋化响应最强,提高恶臭假单胞菌UW4对ACC的代谢速率可显著增强其对ACC的趋化响应强度和根际定殖量,推测ACC是UW4的一种新的代谢依赖型趋化物且为UW4竞争性定殖于作物根际的关键趋化物质。