家蚕A至IRNA编辑的研究

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真核生物前体RNA需要经过一系列的转录后加工才能形成成熟的mRNA,这些加工过程包括选择性剪接、RNA编辑以及RNA3’端多聚腺苷酸化等过程。其中有一种RNA编辑作用是由腺嘌呤脱氨酶(ADARs)介导的,被称为A至IRNA编辑。ADARs是一种RNA编辑酶,作用于双链RNA(dsRNA)上的腺嘌呤,通过水解脱氨作用使腺嘌呤转变为次黄嘌呤。像其它双链RNA结合蛋白一样,ADARs可以非特异性地结合到双链RNA上,一旦结合到双链RNA后,ADARs可以高效地使特定位点上的腺嘌呤脱氨基。大多数酶将腺嘌呤脱氨产物次黄嘌呤识别成为鸟嘌呤,在翻译过程中次黄嘌呤被当作鸟嘌呤,这样ADARs就改变了RNA的原始序列信息。此外,由于次黄嘌呤与胞嘧啶配对,ADARs还可把AU碱基转变为IU碱基对,改变RNA的空间结构。 本研究通过对果蝇中已知的编辑位点的分析比较,鉴定了这些位点在家蚕同源基因的转录产物是否是ADARs的作用位点。对含有编辑位点的果蝇编码区或外显子序列进行BLAST后,我们找到家蚕上相应的同源基因序列,并通过这些序列设计了特异引物。我们提取了家蚕四个发育阶段的总RNA,包括胚胎、幼虫、蛹和蛾,同时从家蚕胚胎中提取基因组DNA。RT-PCR产物用特异引物直接进行测序,通过对cDNA和基因组DNA扩增产物序列的比较,我们发现它们之间有少数几个位点的核苷酸并不匹配。进一步分析的结果表明,这些位点的其中一些就是A至I编辑位点,并最终在家蚕的3个基因中找到了9个A至I编辑位点。 在发现有A至IRNA编辑现象的3个基因中,我们获得了其中Synaptotagmin基因的全编码区,并用蛋白质结构预测软件RasMol对其氨基酸序列进行空间结构预测,发现编辑前后的蛋白质在空间结构上产生了明显的变化。分别将编辑前后的编码区序列克隆到表达载体pGEX-4T-1上,在E.coliBL21菌株中进行表达,希望能通过对编辑前后表达产物活性的比较进一步研究A至IRNA编辑在真核生物中的深远意义。 在对家蚕A至IRNA编辑位点进行研究的过程中,我们还发现了一个有趣的选择性剪接现象,该选择性剪接作用与编辑存在一定的相关性。这个选择性剪接区域存在于家蚕的一种烟碱型乙酰胆碱受体基因Dα6。该基因有两个特殊的外显子,它们大小相同均为45个核苷酸并且69%同源。该基因的PCR产物被克隆到T载体上,测序结果发现有3种不同的剪接方式,产物保留其中一个外显子或同时保留两个外显子。通过对序列的进一步分析,我们发现RNA的A至I编辑和选择性剪接存在着某些有趣的内在联系。
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