研究背景和目的肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居恶性肿瘤第六位,死亡率位居恶性肿瘤第四位。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）（占75%-85%）和肝内胆管癌（占10%-15%）是原发性肝癌最主要类型。手术切除、肝移植或原位消融等治疗对早期HCC患者有效,但由于肝癌的高复发率,病人五年生存率很低。对于进展期病人,现有靶向治疗药物的疗效也非常有限。因此,进一步深入探索肝癌的发生、发展机制,对优化肝癌预防和治疗策略、减少肝癌死亡率具有重要意义。不同于大多数正常组织和细胞主要依赖于外源摄入脂质来满足需求,肿瘤细胞则偏好于从头脂肪酸合成,这种代谢重编程作为肿瘤的特征之一,越来越受到重视。脂肪酸合成代谢在体外肿瘤细胞增殖和存活中的重要意义已经多次被证明,但在体内复杂的微环境尤其是代谢环境下是否有同样的意义仍待继续研究。伴随肿瘤中加强的从头脂肪酸合成的是一系列脂肪酸合成代谢的酶在肿瘤中的表达升高,比如脂肪酸合酶（fatty acid synthase,FASN）、乙酰Co A羧化酶（acetyl-Co A carboxylase,ACC）和ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase,ACLY）。ACLY是连接糖/谷氨酰胺代谢与从头脂肪酸合成的关键酶,其在胞质裂解柠檬酸生成乙酰Co A和草酰乙酸。研究显示,ACLY在多种肿瘤中表达上调并与肿瘤生长相关。其催化产物乙酰Co A是脂肪酸从头合成和胆固醇合成的基本原料,因此干扰ACLY或抑制其酶活性,导致细胞增殖所需原料脂肪酸和胆固醇合成减少从而可抑制肿瘤生长。同时乙酰Co A还是组蛋白乙酰化及非组蛋白乙酰化时乙酰基团的供体,组蛋白的乙酰化修饰在调控基因表达、DNA复制和DNA损伤修复中具有重要作用,ACLY通过改变乙酰Co A丰度,调节组蛋白乙酰化修饰,可特异性调控某些基因位点的基因表达,从而影响细胞增殖、迁移和粘附等,此外,还可通过产生乙酰Co A促进组蛋白乙酰化从而调控同源重组介导的DNA修复和在HBV诱导HCC过程中促进脂肪酸合成。但目前为止,ACLY对肝癌生长及转移等的具体作用和相关机制尚未见报道。肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells,TICs,又常被称为肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs））学说是肿瘤起源的重要理论之一。肿瘤起始细胞是指肿瘤中存在的少量具有和正常组织干细胞相似的特征即自我更新和多分化潜能的细胞。自1994年Tsvee Lapidot等在急性髓系白血病中首次证明肿瘤干细胞的存在以来,越多越多的研究者在不同类型肿瘤中,证实了CSC的存在。多个研究表明,在肝癌中存在肝癌起始细胞（liver tumor-initiating cells,LTICs）,其在肝癌的发生、发展、复发和治疗抵抗中具有重要的作用,靶向LTICs将可能有效解决导致HCC病人死亡的转移、复发和治疗抵抗。本课题旨在探索ACLY对肝癌生物学功能的影响及相关机制,在明确ACLY在人HCC肿瘤组织表达情况的基础上,分析了ACLY表达水平与HCC患者预后及疾病进展情况的关系;通过实验研究了ACLY表达对LTICs的调控作用,对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移能力的影响;并探索了相关的机制。这些发现将有助于进一步深入理解肝癌发生、发展的机制,为肝癌的诊疗提供新思路和新靶标。研究方法1、下载并整理分析公共数据库HCCDB中ACLY的信使RNA（messenger RNA,m RNA）表达情况;并进一步通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot,WB）和免疫组化方法分别检测ACLY在HCC癌组织的m RNA和蛋白水平;2、根据m RNA表达水平将HCCDB数据库中HCC癌组织样本分为ACLY高表达组和ACLY低表达组,分别比较两组总体生存期、死亡风险比以及TNM分期和门静脉侵犯的比例差异;3、利用不同方法富集LTICs,分析ACLY在其中表达情况;检测组织芯片中ACLY与CD133蛋白表达水平,并分析二者相关性;通过si RNA和sh RNA慢病毒建立稳定干扰细胞系,研究ACLY沉默对常见肝癌细胞系Huh7及HCC-LM3的CD133+细胞比例及自我更新的影响;4、在体外,用CCK8和平板克隆形成方法检测ACLY沉默对肝癌细胞增殖的影响;并进一步利用裸鼠皮下移植瘤实验,体内研究ACLY沉默对肝癌细胞生长的影响;5、运用Transwell迁移、划痕和Transwell侵袭实验体外研究ACLY沉默对肝癌细胞迁移及侵袭的影响;通过小鼠尾静脉注射建立肝癌细胞系Huh7的肺转移模型,研究ACLY沉默对肝癌肺转移的影响;6、运用荧光素酶报告基因TOP-Flash分别检测干扰和过表达ACLY对β-catenin介导的转录活性的影响,并通过q RT-PCR和WB检测ACLY表达变化对β-catenin及其靶基因的m RNA和蛋白表达水平的影响,运用核浆抽提检测核内β-catenin表达情况,以研究干扰ACLY表达对经典Wnt信号通路的影响;7、运用环己酰亚胺和蛋白酶体抑制剂,研究ACLY沉默引起β-catenin蛋白降低的机制,通过抑制β-catenin去乙酰化研究乙酰化对β-catenin蛋白表达影响,并用免疫共沉淀检测干扰ACLY表达对乙酰化β-catenin（Lys49）表达水平以及乙酰转移酶CBP和p300与乙酰化β-catenin（Lys49）结合的变化;8、检测干扰ACLY后常见上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）相关标志物的m RNA表达并进一步WB验证,利用β-catenin突变激活质粒过表达激活β-catenin观察对下调的间质标志物（Vimentin、Fibronectin和N-cadherin）的影响;9、研究Wnt/β-catenin通路再激活是否能逆转ACLY沉默导致的LTICs特性的抑制及肝癌细胞迁移能力的降低。结果1、ACLY在肝癌组织m RNA及蛋白表达水平均明显高于癌旁组织;2、与肝癌组织中ACLY低表达组相比,ACLY高表达的患者总体生存期明显降低,死亡风险明显升高,早（I、II）期患者比例锐减,而晚期（III、IV）患者比例增加,门静脉侵犯率显著增高;3、ACLY在LTICs中表达明显高于对照亚群细胞;肝癌组织中,ACLY高表达组其CD133高表达比例明显高于ACLY低表达组;沉默ACLY表达后,Huh7及HCC-LM3中CD133+细胞亚群比例和自我更新能力均明显降低,且LTICs标志物的m RNA表达明显降低;4、干扰ACLY对Huh7、HCC-LM3肝癌细胞系的短期群体性增殖能力未见明显影响,但影响其克隆形成能力;体内实验表明,ACLY表达影响肝癌细胞小鼠皮下移植瘤生长,干扰ACLY组肿瘤形成率降低、生长速度减慢、肿瘤体积和重量明显减少;5、干扰ACLY表达后,肝癌细胞系体外迁移、侵袭能力明显减弱;肺转移瘤模型中,ACLY沉默组肝癌细胞的肺定植能力也显著降低;6、ACLY表达影响Wnt/β-catenin信号通路关键转录激活因子β-catenin介导的转录活性,影响其下游靶基因m RNA及蛋白表达,影响β-catenin蛋白表达;7、干扰ACLY表达影响β-catenin蛋白稳定性,抑制蛋白酶体降解逆转β-catenin表达下调;乙酰化修饰调控β-catenin蛋白表达,干扰ACLY表达下调乙酰化β-catenin（Lys49）水平,降低p300和CBP与乙酰化β-catenin（Lys49）结合;8、干扰ACLY导致肝癌细胞部分EMT标志物（Vimentin、Fibronectin和N-cadherin）表达下调,过表达突变激活β-catenin部分逆转ACLY沉默诱导的间质标志物下调;9、Wnt/β-catenin信号通路再激活逆转ACLY沉默诱导的LTICs干性抑制,部分逆转肝癌细胞迁移能力的下调。结论ACLY在肝癌组织中mRNA和蛋白表达水平均明显上调,ACLY高表达与更差的总体生存期、更高的TNM分期和门静脉侵犯相关。干扰ACLY表达明显抑制LTICs比例和自我更新能力,抑制肝癌细胞体外长期存活和小鼠体内生长能力,抑制肝癌细胞体外迁移、侵袭及体内肺转移瘤形成能力。机制上,干性和肿瘤关键信号通路Wnt/β-catenin通路可被ACLY表达调控,ACLY表达可通过影响β-catenin乙酰化（Lys49位点）从而影响β-catenin稳定性,过表达激活β-catenin可部分逆转上述表型和分子改变。我们的研究明确了ACLY在肝癌生物学功能中的作用,并第一次发现了其通过影响特定蛋白翻译后修饰而调控肿瘤关键信号通路,进一步丰富了代谢分子与肿瘤之间的联系。