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一、研究背景创伤性肺损伤（Traumatic lung injury,TLI）是创伤病人的常见并发症,它是由车祸多发伤、高空坠落伤、严重挤压伤等创伤因素导致的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）,临床表现除了具有ALI的进行性低氧血症、呼吸窘迫等典型症状以外,常合并多脏器损伤、多发骨折、皮肤软组织挫裂撕脱伤等。相对于其他原因导致的肺损伤,创伤性肺损伤病情更加危重、复杂,而且创伤导致的ALI更容易发展成为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）,死亡率高达40-50%。创伤性肺损伤最显著的特点可概括为“三高”:高发病率、高治疗难度、高死亡率。当前针对肺损伤的治疗尤其是ARDS,由于起病机制尚不明确,缺乏行之有效的诊疗措施,当前的治疗主要为保守的对症处理,包括呼吸机支持、激素应用等,而且在体格与影像学检查中,肺损伤的早期表现往往会被其他病变因素掩盖,错失早期治疗的最佳时机。因此,明确创伤性肺损伤的发病机制,寻找肺损伤诊疗相关的新指标和新技术,是当前创伤性肺损伤研究的热点与焦点。近年来,高通量测序与基因检测分析技术的进步发展使得既往研究中被忽略的分子功能得到揭示,越来越多的研究表明lnc RNA（long non-coding RNA,长链非编码RNA）、circRNA（circular RNA,环状RNA）、miRNA（micro RNA,微小RNA）等在多种疾病的诊断与治疗中发挥着重要的作用。circRNA作为最新研究的明星分子,最显著的特点是拥有独特的环状结构、广泛分布以及高度的稳定性、保守性和特异性,是体内检测的理想指标,它能够与对应的miRNA、转录因子等相互作用,在基因转录、翻译等上游水平发挥着重要的调控功能,有望成为新的治疗靶点和特异性标志物。目前已有大量研究表明circRNA是肿瘤、脏器损伤等疾病的临床标志物和潜在治疗靶点,而且其在肺部疾病研究中也有较多报道。比如,研究证实hsacirc0009024在肺结核患者血浆内高表达,抗结核治疗后表达恢复正常,有望成为肺结核治疗的特异性标志物;在低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）的研究中,目前已发现60多个差异表达的circRNA并证实其可能参与疾病调控机制。尽管目前尚无文献直接探讨创伤性肺损伤患者中circRNA的表达情况和作用机制,但已有研究证实circRNA可影响肺损伤中的细胞增殖、活化和凋亡性能。在细胞增殖、迁移方面,circRNA-ZC3H4和circRNA-HECTD1参与矽肺患者肺组织中巨噬细胞的活化,从而促进成纤维细胞的增殖和迁移,证实circRNA可参与肺部炎症进程;而circRNA0003575则能抑制HUVEC（human umbilical vein endothelial cells,人脐静脉内皮细胞）的细胞增殖和血管生成能力。在细胞凋亡方面,研究表明circRNA0010729可通过靶向调节miR-186/HIF-1α轴进而发挥抗血管内皮凋亡的作用,从而降低血管内皮损伤程度、减轻炎症反应。结合目前circRNA的研究现状,考虑到创伤性肺损伤诊疗现状的急迫需求,我们围绕着创伤性肺损伤展开了一系列的circRNA研究。二、研究目的1.通过对创伤性肺损伤样本库中典型样本进行高通量测序及生物信息学分析,建立circRNA表达谱以及潜在的ceRNA（competing endogenous RNA,内源竞争RNA）通路网络;2.通过建立创伤性肺损伤动物模型,明确创伤性肺损伤发生后各项指标的变化情况,并初步检测circRNA表达谱及下游miRNA在动物模型体内的变化;3.通过细胞学实验,明确circRNA在增殖、迁移、凋亡、蛋白水平等生物学功能中的作用及ceRNA通路相关指标的变化情况。三、研究方法1.创伤性肺损伤样本的高通量测序及生物信息学分析首先明确纳入和排除标准、建立创伤性肺损伤样本库,选择其中5对样本（创伤组:5例样本库中典型病例的血浆,对照组:5例健康人血血浆）进行高通量测序,筛选差异表达的circRNA并通过qRT-PCR（荧光实时定量PCR）验证其表达趋势,运用Target-scan和miRanda数据库,借助cytoscape软件和R语言对下游靶基因进行预测,将得到的下游mRNA进行GO和KEGG分析,筛选和肺损伤关系密切的mRNA,并通过提高ceRNA网络筛选标准,进一步筛选可能的ceRNA通路。选择20对样本进行扩大验证,通过qRT-PCR进一步明确筛选的circRNA在创伤性肺损伤中的表达情况。2.创伤性肺损伤动物模型的建立和指标检测将SD-大鼠随机分为四组,分别为:对照组、创伤后4h组、创伤后8h组、创伤后12h组,利用重物垂直打击装置制作创伤性肺损伤动物模型,分别检测各组的呼吸频率、血气指标、肺泡灌洗液中的细胞数目和蛋白含量变化、炎症因子等的表达情况,观察肺脏的大体变化以及病理切片染色情况以明确肺组织的形态改变,提取各组肺组织中的RNA,qRT-PCR检测circRNA以及miRNA的表达情况。3.circRNA及其ceRNA通路在细胞生物学效应中的作用选取A549和Beas-2b细胞作为研究对象,通过慢病毒转染实现circRNA的过表达、siRNA（Small interfering RNA,小干扰RNA）转染实现circRNA的敲减,qRT-PCR检测circRNA表达情况,确定转染效果最佳的慢病毒转染浓度和siRNA,构建circRNA过表达和敲减细胞株,检测circRNA改变对细胞的增殖活性、迁移性能、凋亡指标、蛋白表达以及下游miRNA、mRNA的影响,结合研究结果确定最可能的ceRNA通路。四、研究结果1.创伤性肺损伤样本的高通量测序及生物信息学分析通过5对样本的高通量测序,初步筛选得到了60条具有升高趋势和250条具有降低趋势（fc>2.0,p<0.05）的circRNA,qRT-PCR验证其中5条表达异常的circRNA,选择变化倍数最大的3条[表达量升高:circRNA101523（circTMOD3）;表达量降低:circRNA102927（circ RHBDD1）,circRNA100562（circ RSU1）],运用Target-scan和miRanda数据库,借助cytoscape软件和R语言对下游靶基因进行预测,将得到的mRNA进行GO和KEGG分析,筛选和肺损伤关系密切的mRNA,并通过提高ceRNA网络筛选标准,最后确定了12条ceRNA通路,所有通路均以circTMOD3为起点。20对样本的扩大验证提示circTMOD3在创伤性肺损伤的表达水平与前期测序结果一致。2.创伤性肺损伤动物模型的建立和指标检测利用重物垂直打击装置成功构建了创伤性肺损伤动物模型并检测各项指标变化。造模后,呼吸频率在4h达到峰值,随后呈下降趋势,但总体仍显著高于对照组;p H和p O2（氧分压）显著降低,p CO2（二氧化碳分压）显著升高,在4h时变化最为显著;肺泡灌洗液中的蛋白渗出逐渐增多,TNF-α/MCP/IL-6/IL-1β水平显著升高,细胞数量增多、细胞破裂程度逐渐加重;肺重/体重比值逐渐升高,肺脏水肿明显伴散在出血点,组织切片染色提示支气管及肺泡腔内淤血、部分肺泡萎陷、肺组织结构紊乱、炎性细胞浸润;circTMOD3显著升高,下游miRNA也有差异性表达。3.circTMOD3介导的ceRNA通路在细胞生物学效应中的作用A549细胞的研究中,circTMOD3过表达方面:慢病毒最佳转染MOI值为20,circTMOD3过表达后细胞的增殖、迁移性能均升高,凋亡水平降低,circTMOD3升高1.54倍,下游miRNA表达降低（miR-199a-5p变化最为显著）、mRNA升高（PFR3变化最为显著）,westernblot检测PRF3、GNG5、TBP、EIFNIF1等蛋白含量均有不同程度的升高（PFR3变化最为显著）;circTMOD3敲减方面:干扰效果最佳的siRNA为si974,circTMOD3敲减后细胞的增殖、迁移性能降低,凋亡升高,circTMOD3为对照组的48.5%,下游miRNA表达升高（mir-199a-5p变化最为显著）,mRNA降低（PFR3变化最为显著）,westernblot检测PRF3、GNG5、TBP、EIFNIF1等蛋白含量均有不同程度的降低（PFR3变化最为显著）。Beas-2b细胞的研究结果与A549中的趋势保持一致,circTMOD3过表达方面:根据该细胞MOI=100的推荐值构建过表达细胞株,circTMOD3过表达后细胞的增殖、迁移性能均升高,凋亡降低,circTMOD3升高1.57倍,下游miRNA表达降低（miR-199a-5p变化最为显著）、mRNA升高（PFR3变化最为显著）,westernblot检测PRF3、GNG5、TBP、EIFNIF1等蛋白含量均有不同程度的升高（PFR3变化最为显著）;circTMOD3敲减方面:利用si974构建circTMOD3敲减细胞株,circTMOD3敲减后细胞的增殖、迁移性能降低,凋亡升高,circTMOD3为正常的48.9%,下游miRNA表达升高（miR-199a-5p变化最为显著）,mRNA降低（PFR3变化最为显著）,westernblot检测PRF3、GNG5、TBP、EIFNIF1等蛋白含量均有不同程度的降低（PFR3变化最为显著）。根据PCR及westernblot结果筛选最可能的ceRNA通路:circTMOD3下游miRNA变化最为显著的为miR-199a-5p,mRNA变化最为显著的为PRF3,westernblot提示PRF3蛋白表达量改变程度最为显著,因此我们推测circTMOD3通过调控circTMOD3—miR-199a-5p—PRF3的ceRNA轴参与创伤性肺损伤的病理生理学进程。五、研究结论创伤性肺损伤会导致circTMOD3的升高,circTMOD3通过调控下游miRNA和mRNA的表达水平以调节细胞的增殖、迁移、凋亡和蛋白表达等生物学功能,从而影响疾病进展。本研究结果证实circTMOD3可能通过调控circTMOD3—miR-199a-5p—PRF3的ceRNA轴参与创伤性肺损伤的病理生理学进程,有望成为创伤性肺损伤治疗的特异性标志物和潜在作用靶点。