牛大肠杆菌病是牧场中常见的疾病,由致病性大肠杆菌引起奶牛及犊牛疾病很多,如犊牛腹泻、奶牛大肠杆菌性乳腺炎、子宫炎及产后败血症等等。大肠杆菌为条件性致病菌,大肠杆菌病的发生与饲养管理、代谢病以及环境有很大的关系,因此牧场对大肠杆菌病的防控至关重要。细菌菌影是革兰氏阴性菌失去细胞内容物而形成的细菌空壳,它保留了细胞表面的抗原结构,是一种非常好的可以抵抗细菌性疾病的疫苗。目前制备菌影常用的是用大肠杆菌噬菌体phi X174中的裂解基因E表达的蛋白在细胞膜上形成跨膜孔道的方法。此外,金黄色葡萄球菌核酸酶基因A的表达产物可以将细菌排出的DNA水解为100 bp以下的小片段,与E基因联合表达可以取得较好的裂解效果。本试验选择一个含有15个碱基的柔性Linker将E基因和SN基因进行串联,融合表达后,用同源重组的方法进行目的片段与载体的连接。利用p BV220质粒上的热敏性λp L/p R-c Its857启动控制系统制备菌影,透射电镜观察菌影结构与排空情况,制备出大肠杆菌菌影。利用所制备的菌影进行小鼠免疫学试验。实验共设6组,每个实验组的注射剂量均为10⁹CFU,注射体积均为100μL,间隔两周进行加强免疫,于免疫后收集血清,用间接ELISA的方法进行大肠杆菌特异性抗体Ig G水平的测定。并在28 d后以20倍的LD₅₀的剂量进行腹腔攻毒,连续7天观察小鼠的死亡情况。结果表明所构建的裂解质粒p BV220-Eaa-SN可以对野生型大肠杆菌CE9进行很好的裂解,裂解率达94.8%。经过透射电镜观察,制备菌影效果良好,结构完整,内部中空,在细菌的两端可见跨膜孔道。对冻干后的菌影进行重悬、培养,结果为无细菌生长。用改良的寇氏法计算出大肠杆菌CE9对小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD₅₀)为2.75×10⁷CFU。小鼠免疫学试验结果表明,经过二次免疫后的血清抗体水平,菌影皮下注射组与菌影肌肉注射组、甲醛灭活苗组、甲醛灭活苗+铝胶灭活苗组、菌影灌胃组相比差异极显著（P<0.01）;甲醛灭活苗+铝胶灭活苗组和菌影肌肉注射组之间差异不显著（P>0.05）。甲醛灭活苗组与菌影（灌胃）组相比差异显著（P<0.05）。各实验组间抗体水平顺序为菌影（皮下注射）组>菌影（肌肉注射）组>甲醛灭活苗+铝胶佐剂组>甲醛灭活苗组>菌影（灌胃）组。在攻毒免疫保护实验中,甲醛灭活苗、甲醛灭活苗+铝胶佐剂、菌影（肌肉注射）、菌影（皮下注射）、菌影（灌胃）和PBS对照组的保护率分别为:35%、60%、70%、85%、30%和0%。对小鼠的剖检结果显示,各实验组小鼠与对照组小鼠相比,肺出血情况明显减轻,十二指肠和空肠的水肿、出血情况也较轻,其中病变最轻微的是菌影（皮下注射）组和菌影（肌肉注射）组。综合抗体水平、免疫保护率和剖检结果,在各组中可以起到最好免疫保护效果的是菌影（皮下注射）组。综上所述,菌影对于大肠杆菌疾病的预防效果优于传统的甲醛灭活苗,通过皮下免疫是最佳的免疫途径,是一种非常有潜力的新型疫苗。