卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系统恶性肿瘤。其起病隐匿,大部分患者在确诊时已伴有盆腹腔大量转移。尽管肿瘤细胞减灭术和术后辅以铂类加紫杉类联合化疗能使卵巢癌的近期疗效获得很大提高,但70%晚期卵巢癌患者仍会复发,5年生存率并没有得到明显改善。因此探讨卵巢癌的复发转移机制,寻找新的治疗靶点及方法或可为卵巢癌的临床治疗提供新的思路。近年来许多研究表明肿瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞本身有关更与其所处微环境密切相关。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages,TAMs)是肿瘤微环境中数量最多的一类免疫细胞。已有研究表明,卵巢癌组织中TAMs多为M2型,且M2-TAMs的浸润密度与不良预后之间存在明显的联系。姜黄素(Curcumin)是一种从姜科、天南星科的中药(如姜黄、莪术、菖蒲等)的根茎中提取出的脂溶性多酚类化合物。研究表明,姜黄素能有效地抑制卵巢癌细胞的恶性行为,在卵巢癌的治疗中具有广泛的应用前景。同时姜黄素具有抗氧化、抗菌、抗炎、镇痛和促进伤口愈合等多种功能,在众多炎症疾病模型中展现了其免疫调节的潜力。故本课题主要研究姜黄素对TAMs极化的调控作用及与卵巢癌恶性行为之间的联系,并对相关机制进行初步探讨。第一部分:姜黄素对TAMs极化的调控作用目的:通过不同浓度姜黄素对TAMs的干预,确定姜黄素对TAMs的调控作用方法:(1)使用免疫磁珠分选法从卵巢癌病人的腹水中获取原代TAMs,进行后续培养。(2)通过CCK-8法检测不同浓度姜黄素分别对人卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR-3,以及原代TAMs细胞增殖能力的影响,明确给药范围。(3)采用流式细胞仪检测不同浓度姜黄素干预48h后TAMs表型的变化,确定最佳给药浓度。(4)采用荧光定量PCR法和ELISA法检测TAMs表型相关细胞因子的基因及蛋白表达情况。结果:较高浓度的姜黄素对人卵巢癌细胞增殖有明显的抑制作用,与OVCAR-3细胞系相比,SKOV3对姜黄素敏感性更高。20μM及其以下浓度对OVCAR-3细胞、SKOV3细胞、及原代TAMs细胞的增殖能力均无明显影响,为合适的给药浓度范围。卵巢癌病人腹水中TAMs以M2型居多,CD206~+细胞比例在54.89±2.92(%)。经不同浓度姜黄素干预48h后,CD86~+细胞的比例无明显差异;CD206~+细胞比例显著下降,其中以姜黄素20μM浓度下降最为明显。采用ELISA法检测培养液上清中IL-10和IL-12的分泌水平,结果显示未经姜黄素干预的TAMs上清中IL-10水平高达111.74±27.37ng/L,20μM姜黄素干预48h后,IL-10水平显著下降至14.97±2.30ng/L;IL-12分泌水平由5.01±4.37 ng/L显著升高至25.19±9.83 ng/L。荧光定量PCR结果显示M1相关细胞因子IL-1、IL-12及TNF-αmRNA的相对表达量增加;M2相关细胞因子、趋化因子TGF-β、CCL23及CXCR2 mRNA的相对表达量均明显下降。结论:(1)较高浓度姜黄素能有效地抑制卵巢癌细胞的增殖。(2)从腹水中分选TAMs,构建原代TAMs与卵巢癌共培养模型,是一种能更好地反映疾病状态的可行方案。(3)晚期卵巢癌患者腹水中TAMs多表现为M2型。(4)姜黄素能够调控TAMs的极化,降低M2-TAMs的表达,其中以20μM姜黄素效果最为明显。第二部分:TAMs对卵巢癌恶性行为的影响及姜黄素的干预作用目的:探讨TAMs对卵巢癌恶性行为的影响及姜黄素的干预作用,并对其相关机制进行初步探究。方法:将第一部分实验获得的培养液上清,分别与卵巢癌OVCAR-3、SKOV3共培养。考虑培养液上清中姜黄素代谢问题以及姜黄素自身具有抗肿瘤作用,本研究设立5组,以进一步明确姜黄素可通过调控TAMs极化影响卵巢癌恶性行为。5组分别为:空白细胞组:使用1640培养基培养;Curcumin 20μM组:使用含20μM姜黄素的1640培养基培养;TAMs组:使用第一部分实验中收集的TAMs培养液上清;TAMs(Curcumin 20μM)组:使用第一部分实验中经20μM姜黄素干预后TAMs培养液上清;TAMs+Curcumin 20μM组:使用第一部分试验中收集的TAMs培养液上清,加入20μM姜黄素。按照上述分组,通过CCK-8实验、单层伤口愈合实验和Transwell侵袭实验探讨TAMs对卵巢癌恶性行为的影响及姜黄素的干预作用。通过荧光定量PCR、Western blot检测上皮细胞间充质转化(Epithelial–mesenchymal transition,EMT)相关标志物基因及蛋白表达水平、ELISA测定培养液上清中相关细胞因子含量对可能机制进行初步探究。结果:(1)CCK-8实验结果表明TAMs能明显促进两种卵巢癌细胞的增殖能力(P均<0.001)。TAMs(Curcumin 20μM)组较TAMs组,对细胞的增殖能力起到明显抑制作用(P<0.05)。TAMs+Curcumin 20μM组与TAMs组之间无显著差别。细胞划痕实验及Transwell侵袭实验中,TAMs能够显著促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力。与TAMs组相比TAMs(Curcumin 20μM)组与TAMs+Curcumin 20μM组均能降低细胞迁移、侵袭能力,其中TAMs(Curcumin 20μM)组抑制卵巢癌迁移、侵袭能力更为明显。(2)在细胞划痕实验中我们观察到TAMs组、TAMs(Curcumin 20μM)组及TAMs+Curcumin 20μM组细胞较空白组细胞相比,卵巢癌细胞形态均发生不同程度的变化,其中TAMs组细胞形态变化最为明显,细胞形态细长、伸出触角,呈长梭形,具有明显的间质细胞样改变。与OVCAR-3细胞相比,SKOV3细胞形态变化更为明显。荧光定量PCR与Westernblot实验结果显示,TAMs组E-cadherin mRNA及蛋白表达量均下调,而N-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白表达量均上调,进一步证实卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR-3)与TAMs上清共培养后发生了EMT。与TAMs组相比,TAMs(Curcumin 20μM)组可抑制卵巢癌细胞EMT。ELISA结果显示TAMs组上清中TGF-β1含量高达4204.48+1130.17ng/L,TAMs(Curcumin 20μM)组培养液上清中TGF-β1含量下降至2609.79±275.02 ng/L(P<0.05)。结论:TAMs培养上清能够显著促进卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭的能力。其机制可能与M2-TAMs分泌大量TGF-β1,进而激活TGF-β通路诱导EMT相关。低剂量姜黄素(20μM)主要通过调控TAMs的极化,抑制卵巢癌细胞EMT,从而抑制卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力。