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TGF-β/SMAD信号通路是动物体内胞外信号入核的重要信号通路之一,广泛参与多种细胞过程,如细胞生长、增殖、分化、自噬与凋亡等的调控。自非编码RNAs(主要是miRNAs和lncRNAs)发现以来,其通过TGF-β/SMAD信号通路调控各种细胞过程的研究一直是生物学相关领域的研究热点,但TGF-β/SMAD信号通路调控miRNAs和lncRNAs的研究却很少。实验室前期研究证实TGF-β/SMAD信号通路是调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的关键通路,并发现其受部分miRNAs(如miR-26b和let-7g)的直接调控。本文拟在前期体外培养猪卵泡颗粒细胞中敲减SMAD4后转录组测序工作的基础上,继续以猪卵泡颗粒细胞和TGF-β/SMAD信号通路为研究对象,分析miRNAs和lncRNAs调控TGF-β/SMAD信号通路的机制,以及TGF-β/SMAD信号通路通过miRNAs和lncRNAs调控颗粒细胞凋亡的机制,为揭示非编码RNAs与TGF-β/SMAD信号通路互作机制、TGF-β/SMAD信号通路调控颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁机制,以及提高母猪繁殖力提供理论依据。本文的主要研究结果包含以下4个方面:1、miR-425介导SMAD4对TGF-β/SMAD信号通路的反馈调控利用转录组测序数据和qRT-PCR技术鉴定14个SMAD4敲减后猪卵泡颗粒细胞中差异表达的miRNAs(7个显著上调,7个显著下调)。通过构建的差异表达mRNA-miRNA互作网络图、双荧光素酶活性分析和qRT-PCR方法等发现和证实TGFBR2 基因是其中 4 个 SMAD4 抑制 miRNAs(miR-130a、miR-1306、miR-143 与miR-425)的共同靶基因,其中miR-425的靶向抑制效率最高。启动子区活性分析和染色质免疫沉淀试验(ChIP)发现SMAD4能够直接与miR-425基因启动子区上SBE(SMAD4 binding element)位点结合从而抑制miR-425基因的表达。进一步分析发现,SMAD4可通过miR-425正反馈调控TGFBR2、β-SMAD3水平,说明在猪卵泡颗粒细胞中,miR-425能够介导SMAD4对TGF-β/SMAD信号通路的反馈调控。细胞凋亡分析发现,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,过表达miR-425可促进细胞凋亡,而过表达TGFBR2可挽救miR-425诱导的细胞凋亡;敲减miR-425能够显著抑制细胞凋亡,而敲减TGFBR2可上调miR-425敲减抑制的细胞凋亡,说明miR-425作为促凋亡因子,通过与TGF-β/SMAD信号通路互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡过程。2、TGF-β/SMAD信号通路通过miR-143/FSHR轴调控猪卵泡颗粒细胞凋亡实验室前期发现FSHR与猪卵泡闭锁相关。我们利用RNAi和FACS等技术证实敲减FSHR可促进猪卵泡颗粒细胞凋亡,抑制FSH诱导的细胞内信号(如PKA与AKT)。生物信息学预测发现猪FSHR基因是miR-143的潜在靶基因,荧光素酶报告基因系统和western blot等方法证实miR-143通过与猪FSHR基因3’-UTR结合抑制猪卵泡颗粒细胞中FSHR及其介导的细胞内信号的表达。进一步分析发现miR-143可通过靶向抑制FSHR促进猪卵泡颗粒细胞凋亡。序列分析发现在猪miR-143基因启动子区上存在2个SBE位点。荧光素酶活性和ChIP分析发现SMAD4可作为转录因子,直接与猪miR-143基因启动子上SBE位点结合,抑制其表达。敲减SMAD4后猪卵泡颗粒细胞中FSHR表达水平显著下调,而过表达SMAD4后FSHR表达水平显著上调,但过表达miR-143可抑制SMAD4过表达诱导的FSHR及其介到的细胞内信号。另外,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,利用TGF-β1激活TGF-β/SMAD信号通路,可抑制miR-143表达。总之,以上结果充分说明在猪卵泡颗粒细胞中TGF-β/SMAD信号通路通过miR-143/FSHR轴抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡。3、LincRNA-NORFA通过TGF-β/SMAD信号通路调控猪卵泡颗粒细胞凋亡目前关于调控哺乳动物卵泡闭锁的lncRNAs还未见报道。实验室前期发现了一个在猪卵泡颗粒细胞中表达水平较高的未知转录本,利用RACE技术获得其全序列,生物信息学分析发现该转录本是一个基因间lncRNA(lincRNA)。FISH和qRT-PCR分析发现该lincRNA主要在猪卵泡颗粒细胞中表达,且在卵泡闭锁过程中表达下调,表明该lncRNA与卵泡闭锁相关,因此命名为linc-NORFA(Noncoding RNA involved in the Follicular Atresia)。功能分析发现linc-NORFA可抑制猪卵泡颗粒细胞调亡。影响邻近基因的表达是lncRNAs发挥功能的主要方式之一,qRT-PCR分析发现linc-NORFA可影响其邻近基因特别是miR-126的表达。生物信息学分析发现linc-NORFA上含有miR-126的结合靶点,荧光素酶活性分析发现linc-NORFA作为竞争内源性RNA(ceRNA)吸附成熟的miR-126。FACS结果表明miR-126作为促凋亡因子显著上调猪卵泡颗粒细胞凋亡率,介导linc-NORFA对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控。进一步研究发现TGFBR2是miR-126的一个功能靶基因,linc-NORFA/miR-126轴可通过TGFBR2调控猪卵泡颗粒细胞调亡和TGF-β/SMAD信号通路。相关性分析发现在猪卵泡中linc-NOR FA、miR-126和TGFBR2三者表达水平显著相关。总之,上述研究结果表明linc-NORFA可通过影响TGF-β/SMAD信号通路来调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。4、TGF-β/SMAD信号通路通过lnc-066/236簇调控猪卵泡颗粒细胞的凋亡转录组测序数据分析发现SMAD4敲减后猪卵泡颗粒细胞中9号染色体上750Kb基因组内6个基因差异表达。qRT-PCR分析发现敲减和过表达SMAD4后,猪卵泡颗粒细胞中5个基因差异表达,包括2个相邻的lncRNAs基因(lnc-066和lnc-236)。研究发现lnc-066和lnc-236在猪卵泡闭锁过程中表达下调,敲减lnc-066和lnc-236可促进猪卵泡颗粒细胞调亡。进一步分析发现敲减lnc-066和lnc-236,可下调猪卵泡颗粒细胞中其邻近基因FZD4的表达,及其下游蛋白β-catenin的表达,说明lnc-066/236簇可正调控猪卵泡颗粒细胞中FZD4/β-catenin通路。敲减FZD4抑制FZD4/β-catenin通路,猪卵泡颗粒细胞调亡率显著上调。生物信息学分析发现在猪lnc-066和lnc-236基因启动子区分别发现2个和3个SBE位点。荧光素酶活性和ChIP-qPCR分析发现SMAD4能够作为转录因子,分别与lnc-066和lnc-236基因启动子区上相应的SBE位点结合,进而促进其转录。总之,TGF-β/SMAD信号通路可通过lnc-066/236簇调控FZD4/β-catenin通路介导的猪卵泡颗粒细胞凋亡。综上所述,本文证实miR-425通过TGF-β/SMAD信号通路、TGF-Jβ/SMAD信号通路通过miR-143调控猪卵泡颗粒细胞调亡。同时,本文还证实linc-NORFA通过TGF-β/SMAD信号通路、TGF-β/SMAD信号通路通过lnc-066/236簇调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。