论文部分内容阅读
目的:运用新建立的中药综合毒性快速检测Microtox(微毒测试)技术,客观评价和比较有毒中药毒性大小,建立科学的基于Microtox毒性测试表征的有毒中药毒性分级标准,并进一步探索Microtox技术用于中药毒性快速评价的可行性。 方法:1、建立费氏弧菌Microtox技术应用于中药综合毒性测试的反应体系。2、基于中药综合毒性快速检测Microtox技术,选择现行《药典》及本科教材记载的最具代表性的15味有毒中药(大毒、有毒、小毒各5味)以及5味无毒中药为研究对象,系统研究其对发光菌(费氏弧菌)发光强度影响的药效-毒性效应谱、剂量-反应曲线和剂量-时间-反应关系,客观描述有毒中药毒性效应动力学过程和作用特点,以发光细菌半数抑制浓度(IC50)或标准毒物(ZnSO4·7H2O)相对发光强度参比值作为有毒中药毒性大小的评价指标。3、有针对性地选择临床常用毒性中药苍耳子进行基于Microtox技术的生物综合毒性评价与小鼠急性毒性试验的对比研究。 结果:1、费氏弧菌Microtox技术最优检测体系为:①最优发光条件:费氏弧菌冻干粉平衡15min后加入复苏液1ml,混匀10min,取100μl菌液测试初始发光度,随后立即加入1ml复苏液或待测样品,反应10min后再次测试相应发光强度,上述操作均在15℃±1℃条件下完成。②复苏稀释液、渗透压调节液及七水硫酸锌储备液不干扰费氏弧菌发光强度的测定,本方法特异性良好。③质控样品、定量下限样品批内精密度<5%、批间精密度<10%,准确度在87.81%-101.43%范围内。七水硫酸锌溶液在5mg/L-100mg/L范围内标准曲线方程为y=21.791ln(x)-20.788,R2=0.9981,本方法下ZnSO4·7H2O对费氏弧菌的IC50为25.75mg/L。④对七水硫酸锌储备液及其质控样品分别连续考察120h和8h,其RSD%均<2%,提示其在室温及4℃保存条件下稳定性良好。2、川乌、草乌、马钱子、巴豆、天仙子、山豆根、附子、雷公藤、苍耳子、半夏、吴茱萸、川楝子、重楼、蛇床子、细辛、人参、黄芪、当归、麦冬、巴戟天基于Microtox技术综合毒性检测的IC50值分别为生药0.023g/ml,0.164g/ml,0.068g/ml,0.029g/ml,0.013g/ml,0.042g/ml,0.308g/ml,0.017g/ml,0.033g/ml,0.067g/ml,0.011 g/ml,0.006g/ml,0.069g/ml,0.006g/ml,0.016g/ml,0.066g/ml,0.091 g/ml,0.024g/ml,0.083g/ml,0.038g/ml。3、苍耳子(生品)水提取物、苍耳子(炒黄)水提取物、苍耳子(炒焦)水提取物的发光细菌半数抑制浓度(IC50)分别为生药0.0432g/ml,0.0575g/ml,0.0308g/ml,即基于Microtox技术的综合毒性相对大小为:炒焦水提取物>生品水提取物>炒黄水提取物;苍耳子(生品)水提取物、苍耳子(炒黄)水提取物、苍耳子(炒焦)水提取物小鼠灌胃给药的半数致死量(LD50)分别为生药223.98g/kg,311.86g/kg,206.83g/kg,即基于小鼠急性毒性试验的毒性相对大小为:炒焦水提取物>生品水提取物>炒黄水提取物。进一步的相关性分析表明两种毒性检测方法评价结果总体趋势具有一致性。 结论:1、针对费氏弧菌CS234这一菌株建立的测试体系具有良好的特异性、稳定性、灵敏度、准确度及适应性,提示可应用于中药综合急性毒性的测试。2、毒性中药基于小鼠急性毒性试验(in vivo)、Microtox技术(in vitro)的毒性评价结果均与传统中药毒性分级不尽一致。基于Microtox技术的生物综合毒性评价能够较好地表征各中药的毒性差异,同时,对于传统中医药理论中认为无毒的中药也检测出其具有一定毒性,这与近年来研究中发现补益中药也存在着不为人知的一些潜在毒性的研究结论是一致的。两种毒性评价结果不尽一致,这可能是由于两种毒性评价方法的评价标准各不相同所致,基于Microtox技术的毒性评价检测的是中药的综合毒性,而小鼠急性毒性试验评价是以动物死亡为终点的指标,而并不是临床实际应用的毒性。但是,两种药物毒性评价方法评价标准的优劣以及基于Microtox毒性测试表征的有毒中药毒性分级标准,均还有待将毒性评价结果与临床研究资料相结合进行评定,以及进一步扩大实验样本量,累积实验数据进行验证。3、苍耳子水提取物采用基于Microtox技术的生物综合毒性的评价结果与小鼠急性毒性试验的评价结果具有一定一致性,将Microtox技术用于苍耳子提取物毒性的快速评价具有一定的可行性,但两种毒性评价方法的相关程度还有待扩大样本量进一步研究。