帕金森病（PD）是一种常见的中枢神经系统（CNS）慢性退行性疾病,传统治疗药物尚不能从根本上修复PD多巴胺能神经元丢失。随着对PD发病机制的深入研究,越来越多的新靶点得以发现和应用,包括一些小分子靶向化合物。二十二碳六烯酸（DHA）是脑中最重要的ω-3多不饱和脂肪酸。DHA能促进神经轴突生长和突触形成以及突触蛋白表达,并增加大鼠海马神经元谷氨酸受体的表达。体外实验还证实DHA可促进神经干细胞分化成神经元。而一些非甾体类抗炎药（NSAID）能特异性结合并激活过氧化物酶体增生物激活受体α（PPARα）。阿司匹林（ASA）作为最常见的NSAID,除了抗血小板聚集等,也有一些其他新作用,包括神经保护和抑癌。ASA可显著上调和激活巨噬细胞PPARα,而是否调节神经元的PPARα仍在探索。因此推测DHA与ASA对PD具有保护作用。微小RNA（miRNAs）是小的非编码、单链RNA分子,通常由22个核苷酸组成。miRNA通过碱基配对控制基因表达和触发mRNA翻译阻遏。异常miRNA表达与多种神经系统疾病相关联,如阿尔茨海默病、PD、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、精神分裂症与自闭症等。某些miRNA在PD患者脑组织显著升高,如小RNA-21（miR-21）,参与了分子伴侣依赖的自噬的发生。第一部分利用脑立体定位仪上将6-羟多巴胺（6-OHDA）注射到大鼠左侧黑质脑区建立PD大鼠模型,并通过腹腔注射阿扑吗啡、旷场实验、悬尾实验等行为学方法,检测模型成功与否;利用免疫组化方法,对比大鼠注射侧和对侧黑质、纹状体脑区酪氨酸羟化酶表达情况;为后续实验建立稳定可靠的动物模型。第二部分利用PD大鼠模型、PD患者以及神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为研究对象,通过尼氏染色和FJB染色等形态学检测,QRT-PCR、Western blot等分子学检测手段进一步揭示小RNA-21（miR-21）、PPARα和视黄醇类X受体α（RXRα）的表达情况,以及三者之间可能存在的相互关系,为后续的分子机制研究提供一定的实验基础。第三部分主要选用SH-SY5Y细胞系,首先通过生物信息学技术预测miR-21与PPARα 3’UTR的潜在结合靶点,并通过荧光报告基因检测技术阐明miR-21对PPARα及RXRα表达的调控机制。随后,通过筛选PPARα高表达的SH-SY5Y细胞系,检测炎症通路相关蛋白（NF-κBp65、磷酸化ERK1/2和COX-2）、细胞凋亡信号通路相关蛋白（PTEN、磷酸化AKT和Cαspαse-3）、神经细胞的营养因子（PSD-95、BDNF和GDNF）等多个蛋白质的表达,进一步阐明miR-21—PPARα/RXRα对于神经元细胞的调控机制。最后,利用DHA和ASA两种化合物/药物单独和/或协同处理细胞,通过多种分子手段检测miR-21、RXRα、PPARα的活性,以及mRNA和蛋白质表达水平,并进一步检测炎症通路、细胞凋亡通路和神经营养因子等蛋白质的表达水平,揭示DHA和ASA对于神经元可能的作用机制以及未来的应用前景。第一部分6-OHDA诱导PD大鼠模型的建立与模型鉴定目的:动物模型对于治疗PD新药的研发与应用以及新的治疗策略更为便利。本部分实验通过对SD大鼠左脑纹状体定向注射6-OHDA,通过一系列行为学和病理学检测方法鉴定模型成功与否。建立6-OHDA诱导的PD大鼠模型,为后续的分子机制研究以及药物治疗提供可靠模型基础。方法:1)通过大鼠脑立体定位仪,在大鼠左侧黑质特异性定量注射6-OHDA溶液,定向损伤大鼠左侧黑质脑区,以建立PD大鼠模型。2)造模8周后,通过腹腔注射0.5 mg/kg阿扑吗啡,观察模型大鼠30 min内向健侧旋转圈数来确定造模是否成功;通过旷场实验和悬尾实验,检测大鼠的一系列行为学改变情况;通过免疫组织化学法,检测大鼠脑部注射侧（左侧）和未注射侧（右侧）黑质的酪氨酸羟化酶（TH）表达表达水平。结果:1)脑立体定位注射6-OHDA到大鼠左侧黑质脑区后,经腹腔注射阿扑吗啡可显著诱导大鼠向健侧出现首尾相接的转圈行为,说明造模成功;2)旷场实验中,模型组大鼠横向跨格次数减少、坐立时间增加,明显表现出运动功能障碍;3)悬尾实验结果表明模型组大鼠静止时间增加;4)模型组大鼠黑质、纹状体TH表达的免疫组化结果显示,与未注射侧相比,注射侧黑质和纹状体脑区TH阳性表达率显著降低。结论:实验选用的6-OHDA诱导的PD大鼠模型,其病理形态和形成过程与人的病变相似,而且模型操作简单、易于复制,是制备PD模型较为可靠的方法。第二部分PD大鼠模型及临床患者相关基因表达研究目的:利用PD大鼠模型、PD患者以及SH-SY5Y细胞,通过Western blot、实时定量聚合酶链反应（QRT-PCR）等一系列分子检测技术检测miR-21、PPARαα和RXRα的表达情况,以及三者之间的表达相关性,为后续的分子机制研究提供实验基础。方法:分为在体和离体实验两部分。首先,在细胞水平进一步确定6-OHDA对神经元细胞的损伤作用（尼氏染色和FJB染色）。其次,选用PD大鼠模型,检测PD大鼠各脑区miR-21、PPARα和RXRα的表达情况。随后,进一步在细胞水平以及临床PD患者外周血中检测以上三种物质的表达情况,并通过对比PD患者以及正常受试者miR-21、PPARα和RXRα的水平,研究它们之间的相关性,试图为后续的分子机制研究提供一定基础。结果:1)尼氏染色结果表明,在6-OHDA处理前（0～8小时）,SH-SY5Y细胞中可见明显紫色,而当处理12小时后,紫色显著下降,24小时后完全消失。2)FJB染色结果显示,6-OHDA（1μg/ml）刺激0、4、8小时后,FJB荧光较弱,而在12和24小时后荧光逐渐增强。说明6-OHDA对细胞造成了明显损伤,导致了神经元变性。3)大鼠脑区miR-21、PPARα和RXRα的QPCR结果表明,在前额叶和丘脑注射侧脑区的miR-21表达明显低于对侧。而在其余三个脑区中,注射侧脑区miR-21的水平均高于对侧。其中注射侧黑质比对侧升高了 4.32倍;注射侧PPARα的表达在纹状体和黑质均低于对侧,而在小脑升高;而RXRα仅在两个脑区发生改变,分别是嗅球和小脑,在嗅球表现为降低,而在小脑表现为升高。4)PD患者外周血中的基因检测结果也表明,与正常组对比,PD患者外周血中miR-21显著升高、PPARα降低,而RXRα的表达水平在两组受试者间未出现显著差异。除此之外,相关性分析还发现,在PD患者外周血中,miR-21与PPARα呈现负相关,而与RXRα无相关性。结论:1)以上结果首先在动物、细胞以及人体样本中确定了 miR-21在PD高表达,而PPARα表现为被抑制。2)miR-21与PPARα呈现负相关性。虽然RXRα的表达也未受影响,同时也不存在任何相关性,但是基于RXRα在基因表达调控中的重要作用,相信miR-21极有可能通过某种方式调控PPARα/RXRαα二聚体的形成,进而参与了 PD的发生和发展。第三部分DHA协同ASA调控相关基因保护神经元的分子机制研究目的:利用生物信息学技术以及多种分子检测手段,检测miR-21对于PPARα的表达调控机制。此外,通过细胞实验阐明DHA协同ASA保护神经元的内在机制。方法:1)为确定miR-21对于PPARα表达是否存在一定的关系,将miR-21 mimics或miR-21 inhibitor分别转染细胞,通过QT-PCR和Western Blot检测PPARα表达;2)将含有PPARα 3’UTR的Pgl3-PPARα 3’UTR的荧光质粒共转染SH-SY5Y细胞,通过荧光检测确定miR-21是否直接调控PPARα;3)为探讨DHA和ASA的作用靶点,用TR-FRET-PPARα激活检测试剂盒和TR-FRET-RXRα辅激活因子检测试剂盒进行研究;4)用DHA刺激SH-SY5Y细胞,分别检测miR-21的表达;5)用 pcDNA3.1-PPARα 转染 SH-SY5Y 细胞,并检测 PTEN、pAkt、Caspase-3、NF-κB p65、ERK1/2 和 COX-2 与 PSD-95、BDNF 和 GDNF 蛋白的表达。结果:1)与对照组相比,miR-21 mimic可有效降低荧光素酶活性,而miR-21 inhibitor表现出增加荧光素酶活性的作用,结果提示PPARα有可能是miR-21的靶标。2)miR-21 mimic可以抑制PPARα的蛋白水平,而miR-21 inhibitor诱导PPARα的蛋白水平。3)DHA和ASA分别是RXRα和PPARα的激动剂。DHA对于RXRα的EC50为10.75μM。而ASA对于PPARα的EC50为3.04 μM。4)DHA能提高RXRα结合RXRE（维甲酸X受体反应元件）的能力。ASA能提高PPARα结合PPRE（过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件）的能力。此外,DHA可以增加PPARα蛋白的表达。然而,ASA尽可以增强PPARα的活性,但是无法诱导蛋白水平发生变化,提示ASA增加PPARα活性而不是蛋白量。5)DHA以剂量依赖的方式抑制miR-21,DHA不仅增强PPARα活性,同时可以通过抑制miR-21水平进而接触其对PPARα翻译水平的抑制作用。6)miR-21 mimic可以有效抑制PPARα和RXRα形成异源二聚体。然而,DHA可以有效促进PPARα和RXRα形成异源二聚体。7)PPARα可显著下调PTEN、pAKT、Caspase-3、NF-KB p65、pERK1/2和COX-2的表达,而增强PSD-95、BDNF和GDNF的蛋白水平。结论:DHA和ASA的联合用药可以从多方面发挥作用,进而改善PD的发生。其具体机制是DHA可以激活RXRα并抑制miR-21表达,而ASA可以激活PPARα,被抑制的miR-21无法抑制PPARα的表达,同时活化的RXRα和PPARα形成异源二聚体,进入细胞核的能力提高。随后分别参与调控了细胞凋亡、炎症和神经营养蛋白的表达。