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目的:1、通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体,感染SMMC-7721细胞,获得稳定表达Cas9蛋白的SMMC-7721-Cas9细胞以及My D88基因敲除的SMMC-7721-My D88-/-/My D88+/+混合细胞,搭建CRISPR/Cas9基因编辑平台。2、SMMC-7721-My D88-/-单克隆细胞的筛选与敲除鉴定。方法:1、CRISPR/Cas9基因编辑平台的搭建:(1)设计合成My D88基因特异性的3对sg RNA(sg RNA-1、sg RNA-2、sg RNA-3),并将其连接到表达质粒GV375上,重组的GV375表达质粒与包装质粒共转染到293T细胞内,产生慢病毒颗粒,并通过荧光法检测病毒滴度;(2)确定慢病毒感染的最适MOI,以及嘌呤霉素筛选的最适剂量;(3)首先将Lenti-Cas9-puro慢病毒感染SMMC-7721细胞,经嘌呤霉素筛选得到SMMC-7721-Cas9细胞,然后用Lenti-sg RNA-Cherry病毒感染SMMC-7721-Cas9细胞,获得SMMC-7721-My D88-/-/My D88+/+混合细胞,并通过PCR、测序和Western blot等方法在基因和蛋白水平上进行Pool克隆细胞敲除验证;2、SMMC-7721-My D88-/-单克隆细胞的筛选与敲除鉴定有限稀释法挑取单克隆,运用PCR、测序、TA克隆以及Western blot等方法在基因和蛋白水平上进行单克隆细胞敲除鉴定;结果:1、CRISPR/Cas9基因编辑平台的搭建:(1)测序验证GV375慢病毒重组表达载体构建成功;(2)重组表达载体和包装载体共转染到293T细胞后,产生的慢病毒颗粒滴度为1×108TU/ml以上;(3)流式细胞术检测MOI为100、10、1时,慢病毒感染效率分别92.27%、88.58%和60.03%,确定最适MOI为10;并确定了嘌呤霉素最佳筛选剂量为3μg/ml;(4)成功构建了稳定表达Cas9蛋白的SMMC-7721-Cas9细胞和My D88基因敲除的SMMC-7721-My D88-/-/My D88+/+混合细胞模型,SMMC-7721-My D88-/-/My D88+/+混合细胞测序结果出现套峰,并且My D88蛋白表达水平较正常细胞和空载对照组显著降低;2、SMMC-7721-My D88-/-单克隆细胞的筛选与敲除鉴定:成功挑取SMMC-7721-My D88-/-单克隆细胞,测序验证显示在敲除靶点处插入一个碱基A,TA克隆结果显示为等位基因两条链敲除相同碱基的纯合克隆;在蛋白水平上,Western blot结果显示My D88基因敲除的SMMC-7721-My D88-/-细胞中My D88基因完全不表达,而正常细胞组和空载对照组都有表达。结论:1、成功构建了CRISPR/Cas9慢病毒载体并感染SMMC-7721细胞,获得稳定表达Cas9蛋白的SMMC-7721-Cas9细胞和My D88基因敲除的SMMC-7721-My D88-/-/My D88+/+混合细胞,为敲除SMMC-7721中其他基因提供实验基础;2、成功挑取单克隆细胞,获得My D88等位基因纯合敲除的SMMC-7721-My D88-/-细胞,为研究My D88基因对肝癌细胞作用机制提供了实验基础。