山羊奶中富含短、中链脂肪酸,且种类丰富,短中链脂肪酸具有独特的消化吸收机制,更易被人体消化吸收。山羊乳中的脂肪酸组成和含量又是影响乳品风味和品质的重要因素。FASN是调控乳汁脂肪酸合成代谢的关键酶,它利用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A和NADPH催化合成饱和脂肪酸。奶山羊乳腺中的FASN具有终止脂肪酸碳链延长而形成中链脂肪酸的功能,脂肪酸合酶中的AT/MT功能域对短中链脂肪酸的合成具有转酰基调控作用。因此,对山羊FASN基因表达调控的研究,对于提高羊乳的风味和品质具有重要意义。然而,关于山羊FASN基因的表达调控研究甚少,本研究旨在对山羊FASN启动子结构和功能分析的基础上,对该基因在山羊乳腺上皮细胞中的转录调控机制进行研究。本研究克隆了山羊FASN启动子序列,并对其结构和功能进行了分析。通过定点突变、过表达或干扰转录因子及双分子荧光互补实验分别研究了转录因子SREBP1,LXRα,USF1调控山羊FASN基因转录的分子机制。本研究的主要结果如下:1.山羊FASN启动子克隆与生物信息学分析克隆得到西农萨能羊FASN基因5’侧翼序列1846 bp。生物信息学分析发现,FASN基因启动子具有典型的真核生物启动子元件,TATA-box位于–41 bp处。转录因子在线软件预测分析表明,FASN基因启动子存在PPAR、AP-2、LXR、ER、Sp1、SREBP1c、NF-Y和USF等转录因子结合位点。启动子缺失片段的荧光素酶活性分析表明,具有基本转录活性的启动子核心区域位于–293~–14 bp。其核心区域序列与Gen Bank公布的牛、人和小鼠FASN基因启动子相似性达90%以上,而启动子上游部分序列与其他物种相似性较低。生物信息学分析发现,启动子核心区域含有转录因子Sp1、NF-Y、USF和SREBP1c等的结合位点。2.转录因子SREBP1对FASN启动子的调控作用通过定点突变分析发现,单个突变SREs元件或NF-Y元件后,FASN基础启动子活性显著下降,同时过表达SREBP1能够诱导FASN启动子活性上调;对两个SRE位点进行双突变,FASN基础启动子几乎不具有活性,过表达SREBP1不能诱导FASN启动子活性上升。此外,过表达或干扰SREBP1后均能影响FASN基因启动子活性及内源m RNA丰度。由此得出SREBP1通过两个SREs位点调控FASN启动子活性。3.LXRα调控FASN基因转录的直接和间接作用机制LXRα激动剂T0901317处理山羊乳腺上皮细胞显著上调FASN基因m RNA水平及启动子活性。生物信息学分析发现FASN启动子含有一个LXRE元件和两个SRE元件。通过片段缺失和定点突变分析发现,突变LXRE不能阻止T0901317对FASN启动子活性的诱导作用。LXRE和两个SRE同时突变后,FASN基础启动子活性显著下降,并且T0901317对FASN启动子不具有调控作用。这些结果表明T0901317可能通过LXRE和SREs位点对FASN基因发挥调控作用。干扰LXRα后并不影响T0901317对FASN启动子的诱导作用,同时FASN基础转录活性也没有变化。干扰SREBP1后,T0901317仍能够上调野生型启动子活性(P<0.01)。在LXRE突变启动子组,干扰SREBP1后,T0901317不能够上调启动子活性(P>0.05)。这些结果表明,T0901317激活FASN启动子活性一方面通过LXRα直接结合在LXRE位点上,另一方面通过激活SREBP1的表达使其结合在SREs位点上间接发挥调控作用。并且,在FASN基因的转录调控中,SREBP1对FASN基础转录起关键作用,LXRα起促进作用。4.USF1对FASN启动子的调控作用克隆得到山羊上游刺激因子USF1基因编码区序列933 bp。通过构建USF1基因的过表达载体p EF-Neo-Flag-USF1,转染山羊乳腺上皮细胞发现,过表达USF1后,FASN基因的启动子活性及m RNA表达显著上调(P<0.05)。通过缺失分析发现,FASN启动子上的-70 bp处的E-box对USF1的诱导具有重要作用,而-340 bp处的E-box效应则比较弱。USF1基因干扰后,FASN基因的m RNA水平及启动子活性均显著下降(P<0.05)。进一步对其进行缺失分析发现-340 bp处的E-box元件不是USF1诱导FASN基因转录所必需的,重要的位点是-70 bp处的E-box。5.USF1和SREBP1协同调控FASN基因启动子活性通过USF1和SREBP1过表达载体共转染实验发现,USF1和SREBP1协同调控山羊FASN启动子活性。成功构建了USF1和SREBP1的双分子荧光互补载体p Bi FC-VN155-USF1和p Bi FC-VC155-SREBP1,利用双分子荧光互补实验分析USF1和SREBP1之间的相互作用。与对照组相比,共转染p Bi FC-VN155-USF1和p Bi FC-VC155-SREBP1的山羊乳腺上皮细胞,可以检测到明显的Bi FC信号,且该信号在细胞核和胞质中均有表达,表明USF1和SREBP1在山羊乳腺上皮细胞中存在相互作用。这些结果表明USF1和SREBP1二者可能通过相互作用协同调控FASN基因转录。本研究阐明了山羊FASN基因在乳腺上皮细胞中的转录调控机制,发现SREBP1和LXRα对山羊FASN基因转录发挥重要调控作用。SREBP1可以直接结合在FASN启动子上调控其转录,也可以和USF1相互作用协同调控FASN基因转录。而LXRα一方面可以直接调控FASN启动子活性,另一方面又可以诱导SREBP1的表达间接调控FASN基因转录。本研究阐明了FASN基因的转录调控机制,对调控奶山羊乳腺脂肪酸合成提供了理论依据,为改善羊奶品质奠定了基础。