【摘 要】
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目的:本实验旨在PEDV的分离鉴定,并探究PEDV感染Vero-E6细胞后自噬的发生情况以及lnc RNA 0.1和lnc RNA 9.5调控细胞自噬的分子机制。为更深入探究PEDV感染Vero-E6细胞过程中诱导细胞自噬以及病毒-宿主互作提供了一定的理论依据和实验基础;并且为研究PEDV的致病机理、有效防控PED和新型药物靶点的开发提供了依据。方法:（1）PEDV的分离鉴定,Trizol法提取小
【基金项目】
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第七师-石河子大学科技创新专项项目:第七师猪群疫病调查与综合防控技术的集成示范； 兵团中青年科技创新领军人才计划,项目编号:2017CB002；
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目的:本实验旨在PEDV的分离鉴定,并探究PEDV感染Vero-E6细胞后自噬的发生情况以及lnc RNA 0.1和lnc RNA 9.5调控细胞自噬的分子机制。为更深入探究PEDV感染Vero-E6细胞过程中诱导细胞自噬以及病毒-宿主互作提供了一定的理论依据和实验基础;并且为研究PEDV的致病机理、有效防控PED和新型药物靶点的开发提供了依据。方法:（1）PEDV的分离鉴定,Trizol法提取小肠组织总RNA,琼脂糖凝胶扩增RT-PCR产物,确定为PED阳性病料后利用Vero-E6细胞进行盲传。收集第7代病毒液,将PEDV S基因分为4段进行扩增后测序,对分离毒株S基因进行系统发育进化分析。（2）建立PEDV感染Vero-E6细胞模型,实时荧光定量PCR检测感染后不同时间点LC3基因m RNA的表达情况;Western blotting检测不同时间点LC3蛋白的表达情况;运用Long Man在线软件对lnc RNA-HOTAIR、lnc RNAHOTAIRM1进行猴源同源序列筛选分析。（3）运用在线软件RNAfold分析并生成两条lnc RNA的二级结构图。利用Lnc Locator在线预测软件分析两条lnc RNA分子的核质分布比。利用实时荧光定量PCR检测两条lnc RNA在PEDV感染Vero-E6细胞模型中不同时间点表达情况。设计合成两条lnc RNA的干扰片段,通过RNA干扰技术干扰两条lnc RNA后,Western blotting验证自噬标志蛋白LC3的表达量。使用DIANA-lnc BASE筛选出能与lnc RNA 9.5靶向互作的mi RNA,并运用Target Scan筛选该mi RNA的猴源同源序列,实时荧光定量PCR检测PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点该mi RNA的表达情况,利用双荧光素酶报告系统检测lnc RNA 9.5与mi RNA的靶向结合情况。结果:（1）将制备的PEDV病毒原液在Vero-E6细胞上盲传7代后细胞出现细胞膜融合,细胞聚集形成合胞体并大量脱落;经过RT-PCR验证,扩增PEDV N基因全长为1326bp,结果与预期一致。对该毒株的S基因进行系统发育进化分析结果显示,该毒株属于G-II亚型。（2）在PEDV感染Vero-E6细胞模型中,Western blotting结果显示,6、12、24、36和48 h试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于对照组（P＜0.01）;实时荧光定量PCR结果显示,LC3的m RNA表达量在48 h最高且极显著高于对照组（P＜0.01）,自噬被激活。（3）筛选出自噬相关lnc RNA分子HOTAIR、HOTAIRM1的同源序列lnc RNA 0.1和lnc RNA 9.5。预测结果显示两条lnc RNA分子主要分布于细胞质中。在PEDV感染Vero-E6细胞细胞模型后,随着感染时间的增加,两条lnc RNA 0.1和lnc RNA 9.5的表达水平均升高,在48h表达量最高且差异极显著（p＜0.01）。实时荧光定量PCR结果显示lnc RNA 0.1 si RNA-1和lnc RNA 9.5 si RNA-2分别极显著抑制了lnc RNA 0.1和lnc RNA 9.5 m RNA的表达（p＜0.01）。Western blotting结果显示,lnc RNA 0.1和lnc RNA 9.5被干扰24h和48h后,自噬标志蛋白LC3的表达明显受到抑制（p＜0.01）。使用DIANA-lnc BASE数据库筛选出与lnc RNA 9.5具有靶向结合能力的mi RNA hsa-mir-20a-5p,将mi RNA序列上传至Target Scan数据库筛选出猴源同源mi RNA mml-mir-20a-5p;实时荧光定量PCR结果显示在PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点,mml-mir-20a-5p的m RNA的表达量均降低。成功构建含有Lnc RNA 9.5的野生型和突变型双荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告系统结果显示mml-mir-20a-5p模拟物将pmir GLO-Lnc RNA 9.5-wt的相对荧光素酶活性下降了约28.2%。结论:（1）分离的PEDV毒株测序结果与CH/SCSH425/2018株亲缘关系相近,属于G-II亚型。（2）PEDV感染Vero-E6细胞后会诱导细胞发生自噬。（3）PEDV感染Vero-E6细胞后,促进了lnc RNA 0.1的表达,且lnc RNA 0.1在PEDV诱导细胞自噬过程中起到了促进作用;lnc RNA 9.5在PEDV感染宿主细胞后表达量上调,mml-mir-20a-5p与lnc RNA 9.5靶向结合,lnc RNA 9.5在PEDV诱导细胞发生自噬过程中也起到了促进作用。
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