牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）可以引起腹泻、流产、发热、胎儿畸形等症状的病毒性传染病。由于疾病发病机制的复杂性,没有足够有效的手段来控制和治疗BVD。因此,必须要探索更有效的抗病毒策略来对抗BVDV的感染。研究表明,BVDV-E2蛋白产生的中和抗体能够有效的抑制病毒感染,NS5A蛋白与NS5B蛋白共同构成病毒复制酶,且研究表明NS5B纳米抗体可以抑制BVDV复制。因此,这2个蛋白均有望成为BVDV防治药物的潜在靶标。目前,很多研究显示纳米抗体对于多种病毒,如HIV、HCV、SARS-Co V-2等有良好的抗病毒作用,但是对抗BVDV的效果还不十分清楚,研发BVDV纳米抗体为该病防控提供候选材料。目的:本研究旨在筛选针对BVDV-NS5A/E2蛋白的纳米抗体,得到高特异性的纳米抗体,探究其对病毒复制的影响,为研发抗BVDV生物制剂提供实验材料。方法:（1）将重组质粒p ET30a-E2/NS5A转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经过诱导表达并纯化,获得重组蛋白,检测其反应原性。（2）分别用重组NS5A、E2蛋白免疫羊驼,分离淋巴细胞,使用巢式PCR扩增VHH基因,获得重组质粒p CANTAB-5E,并转化TG1感受态细胞,鉴定目的基因插入率以及文库容量;将噬菌体展示文库,通过三轮固相淘选,ELISA方法验证其结合力。（3）通过分析选择较好纳米抗体序列,构建重组表达载体,并转化,通过诱导表达并纯化,检测其反应原性。（4）将BVDV病毒分别与纳米抗体孵育后接种于MDBK细胞,通过q-PCR分析、评价不同浓度纳米抗体对BVDV病毒复制的阻断能力。结果:（1）获得重组蛋白NS5A、E2,分子量大小分别约为57、39 k Da,经WB验证反应原性良好。（2）获得1个插入率为88.5%,库容量为3.42×10~6CFU/m L的NS5A纳米抗体展示文库,1个插入率为83.3%,库容量为8.4×10~5CFU/m L的E2纳米抗体展示文库。（3）经过三轮淘选,ELISA验证纳米抗体粗提物反应,得到12条纳米抗体,其中5种与E2蛋白结合的纳米抗体,7种与NS5A蛋白结合的纳米抗体。（4）选择其中2条特异性纳米抗体Nb2、Nb8,并获得重组纳米抗体蛋白Nb2、Nb8,分子量大小约15 k Da,经ELISA检测反应原性良好。（5）经细胞试验验证,纳米抗体Nb2、Nb8均对病毒有一定中和能力,其中纳米抗体Nb2短时间内使BVDV拷贝数相比阳性对照组下降了10倍以上。结论:（1）成功原核表达重组蛋白NS5A、E2,构建NS5A/E2噬菌体展示文库,得到特异的纳米抗体。（2）利用原核系统得到Nb2、Nb8纳米抗体蛋白,为BVDV纳米抗体的生物学特性研究提供基础材料。（3）通过细胞试验证实纳米抗体可以阻断BVDV病毒复制。