肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)在我国广为流行，其发病率和病死率近年仍居高不下，严重危害人民的生命健康。已知HFRS的病原——汉坦病毒属病毒(Hantaviruses，HV)的3种结构蛋白中，G1、G2含有病毒的中和抗原表位、血凝素抗原和大部分型特异性抗原表位，是病毒感染致病和引发机体产生免疫应答的主要成份。NP虽然主要与病毒RNA的功能密切相关，但也是重要的免疫原，与机体抗病毒保护性免疫应答有密切关系。HFRS的发病机理至今尚未完全阐明，动物实验表明，HV特异性细胞免疫特别是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)在防护病毒感染中具有重要作用。近年应用单克隆抗体、特异性T细胞克隆、噬菌体肽库和肽扫描等技术的研究表明，HV NP的优势B细胞抗原表位和不同型别病毒间的交叉反应性B细胞抗原表位主要位于蛋白的氨基 第四军医大学博士学位论文 端l”、‘’1，对NP不同表位的抗体应答具有一定的遗传限制性，表现为不同 MHC遗传背景的小鼠对特定表位的抗体应答强度和产生的 lgG亚类有一些差 异，免疫小鼠的辅助丁淋巳细胞在体外培养环境中的增殖速率和分泌的细胞 因子的多少也明显不同。 近年国外学者报告l”，”］，从既往显性或隐性感染HV人群的外周血 中，建立了多株针对 HV汉滩型病毒（HTNV）和普马拉型病毒（PUUV）的 特异性丁细胞克隆或CTL克隆，其中CD4＋或CDS＋的大部分克隆为核衣壳 蛋白（NP）特异性，少数为囊膜糖蛋白（GI）特异性，分别识别不同的由 9－20个氢基酸组成的抗原表位，其中表位特异性的CTL杀伤靶细胞的效应具 有HLA的限制性，并发现存在针对多种型别病毒的交叉反应性CTL。 尽管欧美国家学者近年对汉坦病毒丁细胞抗原表位进行了一些研究，但 是由于各类HLA基因型／表型的分布在不同地区和不同民族间差异较大，我国 HFRS疫区的主要流行毒株型别与欧美也不尽相同，因此上述研究结果井不 能完全适用于我国。此外，上述研究的对象大多为既往的隐性感染者，与 HFRS患者急性期的病毒丁细胞表位及其免疫应答特点可能有一定差别。因 此，本研究拟从我国姬鼠型疫区 HFRS患者外周血单个核细胞（PBMC）建 立C－rL克隆，观察其对HTNV NP不同片段特异性靶细胞的杀伤作用，为进 一步深入研究奠定基础。 1．PBMC分离、冻存用淋巴细胞分离液分离 HFRS患者外周血（每 lml 全血需 50U 肝素抗凝），PBMC 以 5 XIO’～8 XIO’lml 的浓度于 即MH64o、20％臼S、10％二甲基亚矾中冻存备用。 2．BLCL的建立 SX 10’lml PBMC力上等体积 B95－8（EBV高产株）培 养上清液（稀释度13），置37”CS％CO。孵箱培养3—4周，每周加含20％ FBS的RPMll640 0．sml，形态观察转化成功后，冻存备用。 一6一 第四军医大学博士学位论文 3．PBMC的体外刺激 PBMC（2X10’一5X10’lml）在AIMN培养基 中培养，加入 10％健康人 AB血清，经 s射线旧 xlo’rads）照射灭活的 HTNV（：160）。培养第4—5日时加入儿一2（25U／ml），之后培养液每 3天换1次，第7日加入HTNV（t16杆2X10’一3X106／mlm射线照射过的 自体 PBMC，第 11日时再次加入儿－2，第 14日做靶细胞杀伤试验。 4．CTL克隆的建立 采用有限稀释法，在培养系统中加入抗CD3抗体 门2F6 0．IDg／ml）和 Y射线照射过的异体 PBMC作为饲养细胞，每 3天换 1次培养液，每14天加入新的饲养细胞，重新用12F6刺激，并做靶细胞杀 伤试验，阳性孔稀释后再如上述刺激，直至1细胞l孔。 5．靶细胞的建立 含HTNV－S基因片段的重组真核表达质粒转染 BLCL，并用G418筛选出稳定表达HTNV核蛋白及其片段的BLCL细胞克 隆。 6．靶细胞杀伤试验 以CTL作为效应细胞，以稳定表达HTNV－NP不同 肽段的BLCL作靶细胞，进行CTL杀伤试验。所用试剂盒为Promega公司 生产的以测定乳酸脱氢酶（LDH）为指标的杀伤试验试剂盒（CytoTOX 96” Non－Radioactive Cytotoxicity Assay），操作按说明书进行。M后用酶联仪 在490urn处测吸光度A值。 结果：建立的特异性 CTL克隆对表达完整 N P、N P ＆基端和氨基端肽 段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应，平均杀伤率分别为50．2％、39刀％和 25．8％。