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目的胞苷/尿苷单磷酸激酶2（cytidine/uridine monophosphate kinase 2,CMPK2）是一种定位于线粒体膜上的新型单磷酸激酶,参与线粒体DNA补救合成途径。已经被证实在对细菌感染、病毒感染、恶性肿瘤等疾病的治疗方面发挥重要作用。尽管如此,在脓毒症的治疗研究领域,以CMPK2为核心的治疗策略却少有提及,削弱了这一新型靶点的潜在治疗价值。本课题旨在探索CMPK2对脓毒症损伤的具体影响,进而寻找潜在的CMPK2细胞信号调节通路,为脓毒症脏器损伤防治及脓毒症免疫治疗方案提供理论支持和新的药物治疗靶点。方法1.动物层面,繁育CMPK2基因缺陷小鼠,腹腔注射LPS建立脓毒症小鼠模型。获取野生型及基因缺陷型小鼠的血清,ELISA定量分析炎症因子表达水平。获取野生型(CMPK2+/+)和基因缺陷型(CMPK2-/-)小鼠的肺组织,HE染色观察肺组织损伤及炎症浸润程度,免疫组化（IHC）技术观察炎症因子浸润情况。腹腔注射致死剂量LPS,记录野生型及基因缺陷型小鼠的存活时长,绘制生存曲线。2.细胞层面,获取CMPK2+/+和CMPK2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞（PMs）以及骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）,给予LPS刺激,通过q-PCR、ELISA技术分别从m RNA和蛋白水平检测TNF-α表达水平。随后,构建过表达模型,以p CMV6-Entry质粒为载体,设计CMPK2过表达扩增引物,构建CMPK2过表达质粒p CMV6-CMPK2-FLAG,DH5α感受态细胞进行转化。扩增构建好的质粒,转染至RAW264.7细胞,利用遗传霉素G418筛选出稳定过表达的细胞株,通过q-PCR、ELISA分别从m RNA和蛋白水平检测LPS诱导的TNF-α的表达水平。3.分子层面,Western Blot（WB）检测JAK/STAT、MAPK-ERK、NF-κB信号通路相关信号分子活化情况,发现CMPK2上调STAT1磷酸化水平。质谱检测与分析筛选出CMPK2相关蛋白M2型-丙酮酸激酶（PKM2）,免疫共沉淀（Co-IP）明确相互作用情况。激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）对PKM2与STAT1进行共定位。Western Blot和Co-IP进一步明确CMPK2对PKM、STAT1磷酸化的影响,PKM与STAT1之间的相互作用。结果1.血清炎症因子,在腹腔注射LPS构建的脓毒症模型中,小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10均在观察时间窗内呈现出先上升后下降的趋势。其中,CMPK2+/+小鼠血清中的TNF-α浓度在3-9h明显高于CMPK2-/-小鼠。在IL-6、IL-10上,CMPK2+/+与CMPK2-/-小鼠在相同时刻浓度的差异在多次实验中无一致趋势。2.肺组织病理,HE染色结果显示CMPK2+/+小鼠肺组织的炎症细胞浸润情况和肺泡壁破坏情况较CMPK2-/-小鼠更为严重。IHC结果显示LPS造模组与对照组相比,肺组织内出现更多的TNF-α及IL-6的阳性着色。其中CMPK2+/+小鼠TNF-α的阳性着色较CMPK2-/-小鼠更为明显。3.巨噬细胞,在相同LPS刺激后,PMs和BMDMs中TNF-α的浓度亦呈现出先上升后下降的趋势,且来源于CMPK2+/+小鼠的明显高于来源于CMPK2-/-小鼠的,无论是在蛋白水平（ELISA）,还是在m RNA水平（q-PCR）。4.CMPK2-FLAG-RAW264.7,由RAW264.7细胞转染p CMV6-CMPK2-FLAG,经G418筛选稳定表达株后获得。在相同LPS刺激后,CMPK2-FLAG-RAW264.7较转入空载质粒的RAW264.7（p CMV6-Entry-RAW264.7）表达更多的TNF-α,无论是在蛋白水平（ELISA）,还是在m RNA水平（q-PCR）。5.STAT1与PKM2,WB结果显示,CMPK2上调LPS刺激后STAT1的磷酸化水平。Co-IP结果显示PKM2与CMPK2之间无相互作用。质谱检测与分析明确CMPK2相关蛋白PKM2,Co-IP结果显示PKM2与CMPK2之间存在相互作用,CLSM结果显示CMPK2缺陷后,LPS刺激或不刺激情况下,PKM2和STAT1在细胞核定位都较少。LPS刺激后,PKM2和STAT1都大量入核,CMPK2缺陷后PKM2与STAT1共定位减少,STAT1入核减少。进一步的WB和Co-IP结果显示CMPK2缺陷降低PKM2、STAT1在LPS刺激后的磷酸化和入细胞核水平,PKM2与STAT1之间存在相互作用,提示CMPK2可以促进PKM2与STAT1的活化。PKM2与STAT1之间存在相互作用,且CMPK2缺陷显著降低PKM2与STAT1的相互作用。结论CMPK2通过调节PKM2的磷酸化,进而促进STAT1的磷酸化与入细胞核,启动STAT1的炎症放大效应,并可能凭此机制实现了在脓毒症模型中对TNF-α表达水平的上调,从而影响脓毒症急性肺损伤。