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红霉素(erythromycin)是一类应用于临床上的大环内酯类抗生素,由糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)发酵产生。它在保障人类健康方面发挥了重要作用,但令人困惑的是日益严重的耐药性问题。目前已经上市了化学半合成第三代红霉素,但是化学方法有步骤繁琐、引起环境污染等缺陷。探索基因工程方法改造红霉素合成过程,可为新型抗生素的研发开辟新的途径。糖基是许多抗生素母环合成后添加的基团,是其发挥抑菌生物活性所必不可少的组分,也是影响生产菌自我保护等功能的结构基础。通过对糖基的改造可以合成新的代谢产物,而改变糖基转移酶又是改造糖基的主要途径之一。在红霉素合成过程中有两个糖基化过程,一个是大环C-3位上的糖基化,一个是C-5位上的糖基化。糖基转移酶EryBⅤ和EryCⅢ分别负责这两个糖基化反应。本文以这两个糖基转移酶为对象,利用同源重组的方法构建两个糖多孢红霉菌突变体,探索改造糖基结构、合成红霉素衍生物的基因工程新途径。为了失活糖基转移酶EryBⅤ和EryCⅢ,本研究采取基因敲除的方法分别缺失它们的编码基因eryBⅤ, eryCⅢ。为了实现这一效果,分别设计删除这两个基因中130bp碱基得到失活的⊿eryBⅤ,⊿eryCⅢ片段,各在删除部分前后选择1000bp左右的片段进行扩增,形成突变基因的两个同源臂,克隆至pUC18质粒上构建pUC18-⊿eryBⅤ和pUC18-⊿eryCⅢ。鉴定后再将⊿eryBⅤ和⊿eryCⅢ亚克隆至同源重组型质粒pWHM3上,分别构建同源重组质粒pWHM3-⊿eryBⅤ和pWHM3-⊿eryCⅢ。接着将它们分别导入糖多孢红霉菌A226原生质体中,经硫链丝菌肽抗性筛选出A226/pWHM3-⊿eryBⅤ和A226/pWHM3-⊿eryCⅢ整合体菌株各一株,对两者进行生物活性试验和薄层层析,显示质粒的整合均破坏了红霉素合成途径,红霉素A无法正常合成,由此鉴定出两者分别整合到糖多孢红霉菌红霉素合成基因位点。然后,根据pWHM3质粒在无抗环境下的不稳定性,通过抗性负筛的方法进行突变体菌株的筛选,挑取大量克隆检测后筛出1株缺失EryBⅤ酶活性和1株缺失EryCⅢ酶活性的糖多孢红霉菌,分别命名为A226-⊿eryBⅤ和A226-⊿eryCⅢ。两个突变体的生物活性试验表明在分别缺失糖基转移酶EryBⅤ和EryCⅢ活性的情况下,它们的发酵产物对枯草芽孢杆菌都没有抑制作用；进一步的薄层层析结果显示A226-⊿eryBⅤ和A226-⊿eryCⅢ都不积累红霉素A；最后通过质谱分析发酵产物,对它们分子量大小的测定以及对比发现A226-⊿eryBⅤ积累红霉内酯B(EB),A226-⊿eryCⅢ积累3-L-mycarose-红霉内酯B (MEB)。随后,将eryBⅤ和eryCⅢ基因分别克隆至表达质粒pZMW上,导入对应的突变体,结果恢复了突变菌株合成红霉素的能力。本论文成功构建了两个糖基转移酶突变体A226-⊿eryBⅤ和A226-⊿eryCⅢ,这为后续改造糖基结构,合成新的前体或新的红霉素衍生物铺平了道路。此外,两个糖基转移酶编码基因的正确克隆也为进一步研究其酶学特性,将它们应用到组合生物学中合成新物质打下了基础。