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目的:研究四妙勇安汤醇沉药液对体外培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)缺氧损伤模型的影响,探讨四妙勇安汤醇沉药液对缺氧造成的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用机制。方法:用0.1%胶原酶及0.25%胰蛋白酶(1:1)混合酶灌注消化法对健康人脐静脉内皮进行消化,对所消化下来的细胞进行体外原代培养,用光学显微镜从形态学观察,并采用免疫荧光抗体方法对Ⅷ相关抗原进行检测,用这两种方法对所培养的细胞进行鉴定并对其进行传代培养。将实验用细胞分为三组,分别为⑴正常细胞组:正常的人脐静脉内皮细胞加入正常培养液,放入37℃5%CO2培养箱培养24h;⑵模型组:对人脐静脉内皮细胞进行缺氧处理后,加入正常培养液,然后放入37℃5% CO2培养箱进行培养24h;⑶四妙勇安汤组:对人脐静脉内皮细胞进行缺氧处理后,加入含10%四妙勇安汤醇沉药液的细胞培养液后,放入37℃5%CO2培养箱继续培养24h。用四甲基偶氮唑蓝(methythiazoletrazolium, MTT)实验观察四妙勇安汤对实验各组内皮细胞细胞活性的影响,实验用TECAN SUNRISE酶标仪测定实验各组细胞吸光度值;用东芝日产120全自动生化仪测定四妙勇安汤对缺氧内皮细胞各组细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出量的影响;并用免疫荧光化学方法检测各组细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)生成量的表达,用日产Olympus荧光显微镜观察各实验组细胞中黄绿色荧光颗粒数目。结果:(1)对所培养的细胞进行鉴定:①倒置相差显微镜下的形态学观察:可见所培养的细胞刚刚接种时细胞多数聚集成团,周边有细胞向外游离,只有少量细胞单个生长;细胞接种24h后即可见大量细胞贴壁,细胞单层扁平,形态多样,呈现圆形,多角形,部分分化,初长出的细胞为短梭形,3-4d细胞生长最迅速,很快融合成片,7d左右细胞即可长成致密单层,呈典型的铺路石状排列,边界清楚,胞浆丰富,胞核圆形居中,结构清晰,胞质均匀。传代细胞生长更加旺盛,有时可见多核细胞;细胞的形态也更趋多形,可见圆形细胞。随着细胞传代次数增加,细胞增值缓慢,细胞呈现长梭形改变,并迅速碎裂,凋亡。②免疫荧光抗体方法进行Ⅷ因子相关抗原检测:荧光显微镜下观察可见所培养的原代及传代细胞胞浆中均有大量较强黄绿色荧光颗粒,胞核周围尤为明显,而用PBS替代兔抗人Ⅷ因子多克隆抗体的对照组细胞,则无此反应。经此两种方法初步鉴定所培养的细胞为内皮细胞。⑵四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响:三组细胞MTT实验中各孔吸光度值、培养液中LDH漏出量以及免疫荧光化学检测的VEGF生成量的表达量结果经方差分析均为p<0.01,均数做两两比较,结果差异均有显著性。①正常组内皮细胞MTT实验中各孔吸光度值为(0.2804±0.0103),免疫荧光化学检测的VEGF生成量的表达量为(40.6±8.3293),在三组实验细胞中均为最高,培养液中LDH漏出量为(33.5±4.8888),在三组细胞中最低;②模型组细胞MTT实验中各孔吸光度值为(0.1549±0.0247),免疫荧光化学检测的VEGF生成量的表达量为(21.2±6.6466),在三组实验细胞中均最低,细胞培养液中LDH漏出量为(196.8333±19.302),在三组实验细胞中为最高;③四妙勇安汤醇沉药液组MTT实验中各孔吸光度值为(0.2158±0.0301),免疫荧光化学检测的VEGF的生成量的表达量为(28.3±3.7227),均介于正常组和模型组之间,低于正常组,高于模型组;培养液中LDH漏出量为(129.5±25.3909)同样是介于正常组和模型组之间,高于正常组,而低于模型组。三组细胞三种检测指标均数做两两比较,均为p<0.01,差异均有显著性。结论:(1)经过0.1%胶原酶及0.25%胰蛋白酶(1:1)混合酶灌注消化人脐静脉内皮所获得的细胞,经原代及传代培养鉴定为人脐静脉内皮细胞;(2)四妙勇安汤对缺氧所致的人脐静脉内皮细胞的损伤具有一定的保护作用,其作用机制可能与①四妙勇安汤可能增加缺氧细胞的细胞活性;②四妙勇安汤可能减轻缺氧对内皮细胞的损伤,促进细胞有氧代谢,抑制无氧酵解及乳酸堆积来维持细胞膜的功能,有一定的膜保护作用,从而达到对内皮细胞的保护作用;③四妙勇安汤增加细胞中VEGF生成量的表达,影响细胞的内分泌功能,从而减轻缺氧所致的内皮细胞凋亡、坏死,从而最终达到促进血管新生的作用有关。有无其他具体的保护作用机制,还有待于进一步的实验研究。