外泌体是细胞主动分泌的具有膜结构的囊泡,大小约为30-150 nm。外泌体中含有宿主细胞来源的多种蛋白质、DNA、编码以及非编码RNA、脂质等物质,它与肿瘤的形成、生长、转移以及疾病的发生密切相关,因此外泌体已经成为肿瘤诊断和治疗相关研究的热点。然而,目前关于外泌体的膜结构快速精准分析检测技术十分有限,制约外泌体科研与临床研究,本论文提出以外泌体膜作为分析对象,开展了其荧光分析以及荧光成像方法的研究。（1）考虑外泌体的尺寸范围较宽,为实现精准分析,首先进行了外泌体分段分离技术的探索。本文尝试了多种分离技术,包括PEG沉淀法、尺寸排阻色谱法以及超滤法,最后确定方案为通过物理膜过滤的方式,在超滤法基础上实现了大小尺寸不同细胞培养基来源外泌体的分段分离。并且用绿色荧光蛋白（EGFP）对外泌体进行标记,通过受体细胞摄取EGFP标记的外泌体实验验证了 PEG沉淀法和超滤法分离的外泌体保持了正常的功能活性。这为外泌体相关研究提供了可用的实验材料。（2）目前外泌体常见的定量方法基于外泌体总蛋白含量分析,繁琐且容易受到各种杂质蛋白干扰。本文首次提出以外泌体膜上的脂质作为定量分析对象,建立了外泌体总膜脂质测定法（MLA）,具体策略为荧光分析技术结合两种荧光染料借助比率荧光分析来定量外泌体。该策略要求染料A是对外泌体膜敏感的特异性膜染料,染料B是对膜不敏感的水溶性染料,其作为与染料A搭配的内参染料。为此,从四种亲脂性膜染料PKH26、Mem-BDP、Mem-CA和Mem-SQAC中筛选出一种膜特异性染料Mem-SQAC作为染料A,其特点是具有高抗蛋白干扰能力、高抗脂蛋白干扰能力以及高荧光成像信噪比。从两种罗丹明类染料中筛选出磺酸罗丹明作为染料B。实际应用于MCF-7细胞、MCF-10A细胞、HeLa细胞培养基以及乳腺癌病人血清来源的外泌体定量分析,发现血清中含有外泌体的量较多,MCF-7细胞相比HeLa细胞、MCF-10A细胞更容易分泌外泌体。证明此定量方法具有快捷、方便、成本低等特点。这为快速、准确定量外泌体提供了可用的方法和工具。（3）外泌体的大小尺寸与其功能具有紧密联系,但目前缺少可行、准确测定其大小尺寸的成像方法。本文根据外泌体膜粘度与其膜曲率半径的联系,提出了通过测定外泌体膜粘度来评估外泌体大小尺寸的新策略。具体策略为高分辨率的荧光寿命成像（FLIM）结合膜特异性粘度敏感荧光探针Mem-BDP,通过测定外泌体膜上的荧光寿命值（局部粘度）来反映出外泌体的大小尺寸。首先对HeLa细胞和MCF-7细胞来源的大小尺寸不同外泌体样本（10-50、50-100和100-220 nm）用探针Mem-BDP染色标记后进行荧光寿命成像（FLIM）,建立外泌体大小尺寸和荧光寿命值之间的联系,结果表明外泌体的平均荧光寿命值（平均粘度）随着外泌体尺寸的增加而降低。其次应用此方法分别对两组肿瘤细胞和相对应正常细胞、不同种类乳腺癌病人血清来源外泌体进行了荧光寿命成像（FLIM）,结果表明来源于肿瘤细胞外泌体的平均荧光寿命值（平均粘度）高于对应的正常细胞;来源于不同种类乳腺癌病人血清中外泌体的平均荧光寿命值（平均粘度）存在差异性。这为外泌体大小尺寸的精准测定提供了可行的方法。（4）标记方法是影响外泌体单分子定位超分辨成像准确性的关键因素,本文提出优化外泌体超分辨成像准确性的新策略。具体策略为采用蛋白融合技术用荧光蛋白对外泌体进行内源性标记。首先构建了荧光蛋白融合外泌体标志性蛋白的重组质粒,来验证荧光蛋白对外泌体标记的可行性。其次比较了三种不同外泌体标记方法（膜染料、免疫荧光、荧光蛋白）在受体细胞摄取成像中的应用,结果表明荧光蛋白标记是最优标记方法,荧光蛋白标记具有成像结果准确、外泌体原始生物学活性不受影响等特点。最后通过光激活荧光蛋白（PAmcherry）对外泌体的标记,实现了细胞外和细胞内外泌体单分子定位超分辨成像。这为外泌体的无损、实时、可视化成像研究提供了可行的工具。