通过功能性基因的导入纠正功能丧失或在生理水平上表达缺陷的基因成为基因治疗的主要方向。mRNA凭借无需转录过程以及细胞质内表达的特性,可以克服DNA因为细胞核孔因素干扰和CpG免疫原性导致的不同细胞间转染效果的较大差异,同时还具有安全性更高,免疫原性更低等优势。然而mRNA因为其分子量大及本身负电的特性必须借助载体穿越选择透过性的细胞膜实现功能。病毒载体凭借较高的递送效率,成为目前临床利用最多的载体,但其更多用于递送DNA形式,而且存在免疫原性和插入突变的可能性,非病毒载体以递送pDNA(Plasmid DNA)为主但也存在效率低及细胞/机体伤害大等问题。细胞穿膜肽技术则因其良好的生物相容性、功能多样性等优势,越来越多的研究将其运用于递送核酸,然而目前报道的穿膜肽与治疗基因之间都是依靠静电力这种非共价结合,这种结合方式存在诸如结合位点随机性和非特异性结合等问题。本课题组前期建立了可以明显提高TAT介导分子入胞逃逸效率的增强型TAT,eTAT(enhanced TAT),同时,基于RNA结合蛋白U1A可以识别特异性序列的单链RNA形成的茎环结构的特点,在本研究中我们构建eTAT与U1 A蛋白的RBD融合的原核表达质粒并在大肠杆菌中原核表达。利用阳离子交换层析柱,通过对缓冲条件的摸索确定了在20 mM PB6.0+0.3 M NaCl+7 mM MgCl2条件下,可以得到纯度较高且较稳定的eTAT-U1A蛋白。设计并体外转录合成了3’带有U1A结合位点的mRNA。胞外验证二者可以结合形成复合物后,在HEK-293T上进行功能性验证,我们发现eTAT-U1A可以携带3’BSEGFP-mRNA入胞并表达,但效率较低。在验证了可行性后,我们分别从蛋白核酸摩尔比及体系中加入RNA酶抑制剂上进行优化,发现效果并不明显。接着,我们改变了 mRNA结构,发现将U1A结合位点增加至6个,其绿色荧光比例可以提升至10%左右。利用以上优化后的转导条件,在难转染细胞系HaCaT发现其荧光比例也可以达到相当的效果。综上所述,本研究首次提出并初步建立了基于穿膜肽eTAT融合RNA结合蛋白U1A这种特异性更高的mRNA转导方式,丰富了治疗性基因的递送方法,同时为解决难转染细胞的外源基因表达问题提供新的策略。