仿生鲶鱼抗菌肽的克隆、表达与活性检测

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抗菌肽是由微生物、植物、动物及人体等产生的具有抗菌能力的短肽类物质,不仅抗菌活性强、抗菌谱广、合成和杀菌速度快,而且不易诱导抗药菌株的产生,有望成为新一代的抗菌制剂。据报道,受伤鲶鱼parasilurus asotus的上皮组织分泌一种有广谱抗菌性却无溶血活性的抗菌肽—Parasin I,研究发现和其它抗菌肽相比,其抗菌能力更强,对革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌,真菌均有抑制效果。抗菌肽Parasin I是组蛋白裂解产物,不可能通过cDNA方法从鲶鱼组织细胞中得到基因。本研究采取仿生设计和人工合成的技术路线,人工合成仿生鲶鱼抗菌肽DNA序列,经PCR扩增后得到带有不同限制性酶切位点的序列XH1、XH2、XH3。将此基因克隆至载体pGEX-5X-3,成功构建了三元序列重组质粒。测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经IPTG诱导,融合蛋白以包涵体形式高效表达。经SDS-PAGE谱带黑度扫描分析表明,融合蛋白可达细菌全蛋白总量的30%。采用低温诱导的方法,使目的融合蛋白在细胞内减速转译,形成可溶性蛋白。确定最佳诱导条件为:温度20℃,诱导10小时。经过超声处理细胞,盐析,CM-52阳离子交换柱等提取、分离、纯化,得到所期望的有抗菌活性的仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A。已提取纯化的目的肽段对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母等微生物进行抑菌试验,结果表明,对大肠杆菌、特别是革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制活性,其中枯草芽孢杆菌对PaH2A最为敏感。
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