【摘 要】
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L-丙氨酸在医药及保健品、日化、食品及食品添加剂等行业有广泛的应用,因此,L-丙氨酸的高产菌株是市场迫切需要的。本实验室前期成功构建了丙氨酸产生菌MG1655-31(ΔldhAΔpflBΔdadX::alaD),测得其L-丙氨酸产量高于野生型,这为本研究提供了研究依据。本研究以菌株MG1655-31作为出发菌株,利用CRISPR/Cas9技术,在染色体水平进行基因敲除与敲入,通过阻断其它竞争代谢途
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L-丙氨酸在医药及保健品、日化、食品及食品添加剂等行业有广泛的应用,因此,L-丙氨酸的高产菌株是市场迫切需要的。本实验室前期成功构建了丙氨酸产生菌MG1655-31(ΔldhAΔpflBΔdadX::alaD),测得其L-丙氨酸产量高于野生型,这为本研究提供了研究依据。本研究以菌株MG1655-31作为出发菌株,利用CRISPR/Cas9技术,在染色体水平进行基因敲除与敲入,通过阻断其它竞争代谢途径、过表达外源高活性关键酶和丙氨酸外运蛋白等策略,初步构建了L-丙氨酸产生菌。结果显示:(1)CRISPR/Cas9作为一种广泛应用的基因编辑工具,能够对大肠杆菌基因组进行简便、高效、多位点的基因敲除与敲入;(2)多轮基因编辑得到的大肠杆菌菌株MG655-714(ΔldhAΔpflBΔdadX::alaDΔfr dA::alaDΔadhE::alaEΔackA-pta)经22h摇瓶厌氧发酵L-丙氨酸产量由5.54mg/mL提升至15.01mg/mL;5L发酵罐48h厌氧发酵L-丙氨酸产量由7.37mg/mL提升至20.01mg/mL;(3)分别提取发酵过程中不同时间点的大肠杆菌K-12野生型菌株MG1655、经过基因编辑的大肠杆菌菌株MG1655-714的mRNA片段,进行转录组分析。通过差异表达基因Volcano Plot分析、差异表达基因功能富集分析等方式,比较分析两种菌株中与L-丙氨酸生物合成相关的基因在转录水平上的变化,确定敲除metA、sad,通过基因敲入继续增加alaD、alaE的拷贝数,以保障碳流更多的向L-丙氨酸生物合成和分泌方向流动。
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