【摘 要】
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柑橘黄化脉明病(Citrus yellow vein clearing disease,CYVCD)是1988年在巴基斯坦柠檬上首次报道的一种新型病毒病害。目前CYVCD已广泛分布于中国几乎所有的柑橘种植省份,并被认为是对柠檬生产为害最严重的病害之一,其病原物是柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),受该病毒侵染的柠檬等敏感品种植株显示出
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柑橘黄化脉明病(Citrus yellow vein clearing disease,CYVCD)是1988年在巴基斯坦柠檬上首次报道的一种新型病毒病害。目前CYVCD已广泛分布于中国几乎所有的柑橘种植省份,并被认为是对柠檬生产为害最严重的病害之一,其病原物是柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),受该病毒侵染的柠檬等敏感品种植株显示出脉明、叶背水浸、叶片反卷扭曲等症状。CYVCV为柑橘病毒属(Mandarivirus)的正义单链RNA病毒。基因组约7.5 kb,包含6个开放阅读框,编码4种蛋白,分别是REP、TGB、CP及P23。目前对CYVCV的研究多限于检测鉴定、检测方法优化、进化分析等研究,对于病毒与寄主植物互作的研究较少,对其致病机理也仍不甚了解。本研究以尤力克柠檬实生苗的叶片为材料,构建了尤力克柠檬的cDNA文库,同时制备了分别含有CYVCV TGB、CP及p23基因的诱饵载体。利用酵母双杂技术从尤力克柠檬的cDNA文库中筛选出了分别与TGB、CP及P23具有潜在互作能力的寄主蛋白,并对这些寄主蛋白进行了生物信息学分析,此外还对部分筛选出的蛋白进行了一对一验证。以期为今后进一步研究CYVCV与寄主的互作机制提供数据参考。主要研究成果:1.本试验利用Gateway克隆技术构建了尤力克柠檬的核cDNA文库。所构建的文库滴度为4.0×10~6CFU/mL,库容为1.6×10~7CFU,重组率为100%,且插入片段大小也都在1 kb以上,表明所构建的核cDNA文库符合高质量文库要求,能够满足目的蛋白筛选的需要。2.成功构建了分别含有CYVCV TGB、CP及p23基因的三个诱饵载体pGBKT7-TGB、pGBKT7-CP和pGBKT7-P23。试验结果表明,这三个诱饵载体无毒性且无自激活作用,可应用于尤力克柠檬cDNA文库筛选。3.运用构建的诱饵载体pGBKT7-TGB筛选尤力克柠檬cDNA文库,共获得了36种可能与CYVCV TGB蛋白互作的尤力克柠檬蛋白。这36种蛋白关联分析显示,其中生物学过程可分为氧化还原途径、碳代谢途径、过氧化氢分解代谢途径、细胞氧化解毒途径等13类,分子功能可分为转录因子活性、蛋白结合、连接酶活性、过氧化氢酶活性等12类,在细胞组分中的分布可分为类囊体、色素体、胞外区等8类。从中选出15种蛋白进行共转验证,其中new TGB-4、new TGB-5、new TGB-9、new TGB-17、new TGB-14、new TGB-24-2、new TGB-1、new TGB-6、TGB-2、TGB-3、TGB-15、TGB-20等12个蛋白可以与TGB进行互作。4.运用构建的诱饵载体pGBKT7-CP,筛选尤力克柠檬cDNA文库,共获得了31种潜在互作的尤力克柠檬蛋白。对这31种互作蛋白进行关联分析,其中生物学过程可分为光刺激反应、蛋白-发色团连接、光合作用,光系统Ⅰ中的光收获等20类,分子功能可分金属离子结合、蛋白结合、叶绿素结合、氧化还原酶活性等11类,在细胞组分中的分布可分为光系统Ⅱ、叶绿体类囊体膜、光系统Ⅰ等8类。从中选出15种进行共转验证,其中new CP-1、new CP-15、new CP-22、new CP-20、new CP-8等5个蛋白可以与CYVCV的CP进行互作.5.运用构建的诱饵载体pGBKT7-P23,筛选尤力克柠檬cDNA文库,共获得了33种潜在互作的尤力克柠檬蛋白。对这33种互作蛋白进行关联分析,其中生物学过程可分为氧化还原途径、泛素化、细胞氧化解毒、SCF依赖的蛋白酶体泛素依赖蛋白降解途径等15类,分子功能可分为泛素蛋白连接酶活性、叶绿素结合、库林家族蛋白结合、过氧化氢酶活性等13类,在细胞组分中的分布可分为细胞核、膜的组成部分、光系统Ⅰ等12类。从pGBKT7-P23筛选的潜在互作蛋白中选出15种进行共转验证,其中new P23-10、new P23-11、new P23-4-1、new P23-17、new P23-22、new P23-20、new P23-24、P23-2、new P23-5等9个蛋白可以与CYVCV的P23互作。
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