木质纤维素是地球上最丰富和廉价的可再生资源,利用木质纤维素原料生产生物乙醇一直备受关注。木糖是木质纤维素水解产物中的第二大糖类,其有效利用是木质纤维素生物乙醇产业化的前提之一。Spathaspora passalidarum是最近发现的一种能天然利用木糖产乙醇的酵母菌株,其发酵木糖的速度比葡萄糖快,而且能混合发酵木糖、葡萄糖和纤维二糖。本文对一株Spathaspora passalidarum NRRLY-2790突变株U-30的木糖乙醇发酵进行了研究,初步建立了Spathaspora passalidarum的遗传转化体系,并利用该体系在Spathaspora passalidarum中进行了初步的基因表达研究,为进一步研究Spathaspora passalidarum木糖乙醇发酵奠定了一定的基础。论文的主要研究内容及结果如下:(1)在摇瓶条件下研究了发酵培养基和发酵条件对U-30利用木糖发酵产乙醇的影响,得到的优化发酵培养基中初始木糖浓度为100 g/L,氮源为15 g/L的玉米浆,发酵条件为:温度30℃、接种量7%(v/v)、初始pH 5.5、转速120 r/min、装液量100mL/250 mL。在此优化后的发酵培养基和发酵条件下,U-30的乙醇浓度达到39.04 g/L,乙醇得率为0.40 g/g,乙醇生产速率为0.325 g/(L·h)。(2)以优化的摇瓶发酵培养基为基础,在1L发酵罐中,进一步分析了pH、通气比和转速对U-30木糖发酵产乙醇的影响。结果发现全程控制pH 5.5与只控制初始pH 5.5对比,乙醇产量和生物量都无明显差别,而搅拌转速和通风比则对发酵有很大的影响。当搅拌转速为150 r/min,通风比为0.125 vvm时,乙醇浓度达到40.2 g/L,乙醇得率为0.406 g/g,乙醇生产速率达到0.744 g/(L·h),与摇瓶相比,发酵罐中的发酵周期明显缩短。(3)以KanMX筛选标记和酿酒酵母2μ复制点为基础,构建了载体Yep352-Kan,并通过醋酸锂转化方法成功实现了载体Yep352-Kan对Spathaspora passalidarum的转化。在此基础上进一步探讨了菌体生长时期、质粒DNA的加入量、热激时间和醋酸锂浓度对转化效率的影响,得到优化后的转化条件为:取对数生长中期的细胞(此时OD600约为15),质粒DNA加入量为2.5 μg,热激时间20 min,醋酸锂浓度为0.5 mol/L,此时转化效率达到170±30 cfu/μg。(4)利用上述转化系统,在Spathaspora passalidarum中进行了过表达XUT1基因研究。对获得的重组菌株与原菌进行发酵性能对比,在摇瓶中发酵5 d后,发现重组菌株的木糖利用和乙醇产量并没有明显改变。在重组菌株U-TXK3中XUT1基因表达量是原菌的4.6倍,初步证实了此转化系统的有效性。