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microRNA(miRNA)是参与动植物RNA干扰(RNAi)的一类长度为18~25nt的非编码RNA分子，在转录后水平通过沉默靶标基因的表达参与动植物生长、发育、生物和非生物胁迫应答等多个生理过程。近年来，真菌miRNA-likeRNA(milRNA)开始被挖掘和鉴定，但其生物学功能和作用机理尚不明确。本课题组前期对严重危害枝干导致烂皮枝枯甚至死树的苹果树腐烂病进行了系统全面研究，已经对病原菌(黑腐皮壳属真菌Valsamali，无性态为苹果壳囊孢Cytosporamali)的致病机理进行了深入探索，发现病原菌RNAi通路的关键蛋白DCL和AGO在致病过程和非生物胁迫应答等重要生物学过程中发挥重要作用，推测转录后水平调控参与该病原菌的这些生物学过程。
为此，本研究首先通过深度测序和生信分析鉴定该病原菌的milRNA，揭示其在病菌离体培养菌丝体和侵染阶段的差异表达情况。并通过降解组测序鉴定milRNA靶标基因，结合转录组测序进一步揭示milRNA与靶标基因的调控关系。进而通过遗传学、分子生物学、组织学、生物化学等研究手段，深入解析milRNA在病菌致病中的功能及作用机理，本论文取得的主要研究结果如下：
1.系统鉴定并初步筛选出病菌致病相关milRNA。利用深度测序及生物信息学分析，分别对V.mali离体培养菌丝体(MVm)和病菌侵染阶段样品(IVm)进行了milRNA鉴定，共鉴定到57个milRNA，其中在MVm中鉴定到56个，在IVm中鉴定到15个，在MVm和IVm中共表达的有14个。该病原菌的milRNA5’端具有较强的U碱基偏好性，还发现两个milRNA由同一个前体产生的情况，长度为20、21和22nt的milRNA占总数量的70.2%。显著性差异表达分析发现，有14个milRNA在MVm中显著上调表达而在IVm中显著下调表达，有2个milRNA在IVm中显著上调表达而在MVm中差异下调表达。这16个在MVm和IVm中差异表达的milRNA可能为病菌致病相关milRNA，其中Vm-milR16是MVm相对于IVm上调倍数(4.1倍)最高的，而Vm-milR1是IVm相对于MVm上调倍数(9279.4倍)最高的。
2.明确了致病相关milRNA的靶标基因。利用降解组测序的方法对milRNA在V.mali中的靶标基因进行了鉴定，共有356个靶标基因转录本可能被45个milRNA调控，在MVm和IVm中分别鉴定到335个和42个可能受到milRNA调控的靶标基因转录本。靶标基因功能注释发现这些靶标基因主要参与信号转导、碳水化合物代谢、翻译、运输等生理生化过程。进一步通过对milRNA、降解组、转录组测序数据和靶标基因中致病相关基因鉴定联合分析发现在MVm中特异表达或上调表达而在IVm中不表达或下调表达的Vm-milR6、Vm-milR7、Vm-milR8、Vm-milR9、Vm-milR13、Vm-milR14、Vm-milR16和Vm-milR37等22个milRNA与其对应的靶标基因具有相反的表达模式，这些milRNA的靶标基因在MVm中下调表达，而在IVm中上调表达，其中的16个靶标基因可能为病菌致病相关基因，说明milRNA可能在MVm中负调控靶标基因特别是一些致病相关基因的表达。生物信息学分析发现，在病菌侵染阶段高度上调表达的Vm-milR1可能靶向多个苹果类受体蛋白(RLK)编码基因。这些结果表明milRNA可能通过负调控靶标基因的表达影响病菌的致病性。
3.通过构建milRNA过表达转化株/敲除突变体和致病力测定筛选获得了病菌致病相关的关键milRNA。根据milRNA的差异表达情况和靶标基因鉴定情况，通过过表达或敲除试验获得了27个milRNA的过表达转化株或敲除突变体，结合活体接种的致病力评价发现，Vm-milR2,14(Vm-milR2和Vm-milR14共用一个前体，下同)、Vm-milR3,13、Vm-milR8,19、Vm-milR9,17、Vm-milR10,48和Vm-milR16过表达转化株的致病力与野生型相比均显著下降，且Vm-milR16过表达转化株致病力下降幅度最大；而Vm-milR1前体敲除突变体在苹果枝条和叶片上的致病力分别下降79.9%和90.5%。这些结果表明，苹果树腐烂病菌存在多个影响致病的milRNA，且Vm-milR16和Vm-milR1为其致病相关的关键milRNA。
4.深入研究发现Vm-milR16通过调控包括一个效应蛋白基因在内的多个内源靶标基因的表达影响病菌的致病性。基于降解组测序分析发现，V.mali蔗糖非发酵激酶基因(VmSNF1)、4，5-多巴雌二醇双加氧酶基因(VmDODA)、假想蛋白基因(VmHy1)和候选效应蛋白基因(VmSP1)可能为Vm-milR16的靶标基因。利用5’RLM-RACE技术，鉴定到了1个Vm-milR16靶向切割VmSP1转录本的位点。颈环qRT-PCR分析发现Vm-milR16在病菌侵染阶段下调表达，这与小RNA测序分析的表达模式一致。qRT-PCR分析表明VmSNF1、VmDODA、VmHy1和VmSP1在病菌侵染过程中均上调表达。Vm-milR16在其过表达转化株Vm-milR16-OE-2和Vm-milR16-OE-8中分别上调表达8和6倍左右。与野生型相比，各靶标基因在Vm-milR16-OE-2中下调表达44.3%~97.9%，在Vm-milR16-OE-8中的表达量下降42.7%~95.5%。与野生型相比，Vm-milR16-OE-2和Vm-milR16-OE-8的在苹果枝条上的病斑长度分别下降48.1%和38.7%，生物量分别下降88.2%和84.0%，而过表达突变的Vm-milR16(Mut-R16)不具有这些作用，说明Vm-milR16以序列特异性的方式调控靶标基因的表达和病菌致病力。重要的是，VmSNF1、VmDODA、VmHy1和VmSP1敲除突变体的致病力显著降低，说明这些基因为病菌的致病相关基因。其中，VmSNF1在病菌侵染过程中通过正调控果胶酶基因的表达而影响病菌的致病力。体外H2O2胁迫试验和活体接种检测ROS积累试验表明，VmSNF1、VmDODA和VmHy1均参与病菌的氧化胁迫应答。利用酵母信号肽捕捉试验证明了VmSP1具有分泌功能。上述结果表明，Vm-milR16能够通过在离体菌丝生长阶段特异性抑制多个致病相关基因的表达，而在侵染过程中，Vm-milR16的表达量明显降低，抑制作用解除，这些致病相关基因表达明显上调从而发挥致病功能。
5.更有趣的发现是Vm-milR1可以跨界抑制寄主类受体蛋白激酶基因的表达干扰寄主免疫反应。基于深度测序、差异表达分析以及颈环RT-PCR检测发现，Vm-milR1在病菌侵染过程中高度诱导表达。敲除Vm-milR1的前体后，病菌不能产生Vm-milR1且致病力大幅度下降。预接种Vm-milR1前体的敲除突变体可显著提高寄主对病菌野生型的抗性。进一步的研究表明，接种Vm-milR1前体敲除突变体可促进寄主ROS的产生、胼胝质积累和免疫相关基因的表达等PTI反应。通过生物信息学分析发现，多个苹果类受体蛋白基因(RLK)可能为Vm-milR1的靶标基因。进一步分析发现，苹果MdRLKT1和MdRLKT2的表达能够被病菌野生型侵染所抑制，而Vm-milR1前体敲除突变体侵染寄主后则可高度诱导MdRLKT1的表达但不抑制MdRLKT2的表达。烟草共表达试验及靶向位突变分析表明，Vm-milR1以序列特异性的方式沉默MdRLKT1和MdRLKT2的表达。分别在本氏烟中瞬时表达MdRLKT1和MdRLKT2可诱导ROS产生、胼胝质积累和免疫相关基因的表达等PTI反应进而提高本氏烟对核盘菌的抗性。更重要的是，分别在苹果叶片中过表达MdRLKT1和MdRLKT2能够激发苹果免疫相关基因的表达、促进ROS产生和胼胝质积累等PTI反应从而提高寄主对病菌的抗性。这些结果表明该病菌利用Vm-milR1作为非蛋白效应子跨界沉默寄主PTI相关基因的表达破坏寄主基础免疫反应。
本研究为深入解析milRNA调控的病菌与寄主的互作机理奠定了重要基础，丰富了对真菌milRNA功能及其调控机理的认知。
为此，本研究首先通过深度测序和生信分析鉴定该病原菌的milRNA，揭示其在病菌离体培养菌丝体和侵染阶段的差异表达情况。并通过降解组测序鉴定milRNA靶标基因，结合转录组测序进一步揭示milRNA与靶标基因的调控关系。进而通过遗传学、分子生物学、组织学、生物化学等研究手段，深入解析milRNA在病菌致病中的功能及作用机理，本论文取得的主要研究结果如下：
1.系统鉴定并初步筛选出病菌致病相关milRNA。利用深度测序及生物信息学分析，分别对V.mali离体培养菌丝体(MVm)和病菌侵染阶段样品(IVm)进行了milRNA鉴定，共鉴定到57个milRNA，其中在MVm中鉴定到56个，在IVm中鉴定到15个，在MVm和IVm中共表达的有14个。该病原菌的milRNA5’端具有较强的U碱基偏好性，还发现两个milRNA由同一个前体产生的情况，长度为20、21和22nt的milRNA占总数量的70.2%。显著性差异表达分析发现，有14个milRNA在MVm中显著上调表达而在IVm中显著下调表达，有2个milRNA在IVm中显著上调表达而在MVm中差异下调表达。这16个在MVm和IVm中差异表达的milRNA可能为病菌致病相关milRNA，其中Vm-milR16是MVm相对于IVm上调倍数(4.1倍)最高的，而Vm-milR1是IVm相对于MVm上调倍数(9279.4倍)最高的。
2.明确了致病相关milRNA的靶标基因。利用降解组测序的方法对milRNA在V.mali中的靶标基因进行了鉴定，共有356个靶标基因转录本可能被45个milRNA调控，在MVm和IVm中分别鉴定到335个和42个可能受到milRNA调控的靶标基因转录本。靶标基因功能注释发现这些靶标基因主要参与信号转导、碳水化合物代谢、翻译、运输等生理生化过程。进一步通过对milRNA、降解组、转录组测序数据和靶标基因中致病相关基因鉴定联合分析发现在MVm中特异表达或上调表达而在IVm中不表达或下调表达的Vm-milR6、Vm-milR7、Vm-milR8、Vm-milR9、Vm-milR13、Vm-milR14、Vm-milR16和Vm-milR37等22个milRNA与其对应的靶标基因具有相反的表达模式，这些milRNA的靶标基因在MVm中下调表达，而在IVm中上调表达，其中的16个靶标基因可能为病菌致病相关基因，说明milRNA可能在MVm中负调控靶标基因特别是一些致病相关基因的表达。生物信息学分析发现，在病菌侵染阶段高度上调表达的Vm-milR1可能靶向多个苹果类受体蛋白(RLK)编码基因。这些结果表明milRNA可能通过负调控靶标基因的表达影响病菌的致病性。
3.通过构建milRNA过表达转化株/敲除突变体和致病力测定筛选获得了病菌致病相关的关键milRNA。根据milRNA的差异表达情况和靶标基因鉴定情况，通过过表达或敲除试验获得了27个milRNA的过表达转化株或敲除突变体，结合活体接种的致病力评价发现，Vm-milR2,14(Vm-milR2和Vm-milR14共用一个前体，下同)、Vm-milR3,13、Vm-milR8,19、Vm-milR9,17、Vm-milR10,48和Vm-milR16过表达转化株的致病力与野生型相比均显著下降，且Vm-milR16过表达转化株致病力下降幅度最大；而Vm-milR1前体敲除突变体在苹果枝条和叶片上的致病力分别下降79.9%和90.5%。这些结果表明，苹果树腐烂病菌存在多个影响致病的milRNA，且Vm-milR16和Vm-milR1为其致病相关的关键milRNA。
4.深入研究发现Vm-milR16通过调控包括一个效应蛋白基因在内的多个内源靶标基因的表达影响病菌的致病性。基于降解组测序分析发现，V.mali蔗糖非发酵激酶基因(VmSNF1)、4，5-多巴雌二醇双加氧酶基因(VmDODA)、假想蛋白基因(VmHy1)和候选效应蛋白基因(VmSP1)可能为Vm-milR16的靶标基因。利用5’RLM-RACE技术，鉴定到了1个Vm-milR16靶向切割VmSP1转录本的位点。颈环qRT-PCR分析发现Vm-milR16在病菌侵染阶段下调表达，这与小RNA测序分析的表达模式一致。qRT-PCR分析表明VmSNF1、VmDODA、VmHy1和VmSP1在病菌侵染过程中均上调表达。Vm-milR16在其过表达转化株Vm-milR16-OE-2和Vm-milR16-OE-8中分别上调表达8和6倍左右。与野生型相比，各靶标基因在Vm-milR16-OE-2中下调表达44.3%~97.9%，在Vm-milR16-OE-8中的表达量下降42.7%~95.5%。与野生型相比，Vm-milR16-OE-2和Vm-milR16-OE-8的在苹果枝条上的病斑长度分别下降48.1%和38.7%，生物量分别下降88.2%和84.0%，而过表达突变的Vm-milR16(Mut-R16)不具有这些作用，说明Vm-milR16以序列特异性的方式调控靶标基因的表达和病菌致病力。重要的是，VmSNF1、VmDODA、VmHy1和VmSP1敲除突变体的致病力显著降低，说明这些基因为病菌的致病相关基因。其中，VmSNF1在病菌侵染过程中通过正调控果胶酶基因的表达而影响病菌的致病力。体外H2O2胁迫试验和活体接种检测ROS积累试验表明，VmSNF1、VmDODA和VmHy1均参与病菌的氧化胁迫应答。利用酵母信号肽捕捉试验证明了VmSP1具有分泌功能。上述结果表明，Vm-milR16能够通过在离体菌丝生长阶段特异性抑制多个致病相关基因的表达，而在侵染过程中，Vm-milR16的表达量明显降低，抑制作用解除，这些致病相关基因表达明显上调从而发挥致病功能。
5.更有趣的发现是Vm-milR1可以跨界抑制寄主类受体蛋白激酶基因的表达干扰寄主免疫反应。基于深度测序、差异表达分析以及颈环RT-PCR检测发现，Vm-milR1在病菌侵染过程中高度诱导表达。敲除Vm-milR1的前体后，病菌不能产生Vm-milR1且致病力大幅度下降。预接种Vm-milR1前体的敲除突变体可显著提高寄主对病菌野生型的抗性。进一步的研究表明，接种Vm-milR1前体敲除突变体可促进寄主ROS的产生、胼胝质积累和免疫相关基因的表达等PTI反应。通过生物信息学分析发现，多个苹果类受体蛋白基因(RLK)可能为Vm-milR1的靶标基因。进一步分析发现，苹果MdRLKT1和MdRLKT2的表达能够被病菌野生型侵染所抑制，而Vm-milR1前体敲除突变体侵染寄主后则可高度诱导MdRLKT1的表达但不抑制MdRLKT2的表达。烟草共表达试验及靶向位突变分析表明，Vm-milR1以序列特异性的方式沉默MdRLKT1和MdRLKT2的表达。分别在本氏烟中瞬时表达MdRLKT1和MdRLKT2可诱导ROS产生、胼胝质积累和免疫相关基因的表达等PTI反应进而提高本氏烟对核盘菌的抗性。更重要的是，分别在苹果叶片中过表达MdRLKT1和MdRLKT2能够激发苹果免疫相关基因的表达、促进ROS产生和胼胝质积累等PTI反应从而提高寄主对病菌的抗性。这些结果表明该病菌利用Vm-milR1作为非蛋白效应子跨界沉默寄主PTI相关基因的表达破坏寄主基础免疫反应。
本研究为深入解析milRNA调控的病菌与寄主的互作机理奠定了重要基础，丰富了对真菌milRNA功能及其调控机理的认知。