Dynamin-1敲除小鼠繁殖饲养、基因分型和Dynamin-1对肾上腺嗜铬细胞分泌融合小孔的调节作用

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Dynamin,又称动力蛋白或发动蛋白,是一类96kD大小,具有鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase, GTPase)活性的蛋白质家族。已发现Dynamin家族广泛参与真核细胞泡管状膜结构的缩紧、闭合与脱离,并参与细胞骨架再构建过程,参与细胞器的质膜运转与回收,细胞囊泡分泌与内吞等多重功能。对于神经与神经内分泌系统,有效回收囊泡并构成有序的循环,是维持神经元或神经内分泌细胞正常生理功能的重要环节。而主要分布于神经与神经内分泌系统的Dynamin1介导多种内吞囊泡与质膜离断,使内吞囊泡顺利输送至胞内,以维持神经元或神经内分泌细胞的正常生理功能。Dynamin1的突变至今被发现是某些神经系统疾病的病因,如:癫痫、神经退型性疾病,并可能引起某类肾病综合症与肾衰。根据国际上观点与实验室先前的研究,发现不论以突变或分子物质干扰Dynamin1,不但影响细胞的内吞功能,同时还影响分泌。耶鲁大学De Camilli实验室为排除Dynamin1于内吞作用研究中,使用突变或药物而产生的非特异作用,于2007年构建Dynamin1敲除小鼠(Dynamin1Knockout mice)。目前,利用转基因动物对Dynamin1于分泌中的效应研究仍然阙如,为进一步研究Dynamin1于囊泡分泌中的功能,我们引进De Camilli实验室构建的Dynamin1敲除小鼠,进行转基因小鼠动物模型的基因分型鉴定与照护传代,保证遗传背景一致的条件下改善动物质量,并利用电化学、电生理与电镜方法,观察肾上腺嗜铬细胞Dynamin1对囊泡分泌的影响。我的研究发现:1. Dynamin1KO小鼠胚胎能顺利发育与产出,但随Dynamin1缺失的影响显现,于一周内死亡。2. Dynamin1KO小鼠乳鼠体重刚出生时与同窝其他基因型乳鼠无明显差异,但随日龄增加体重无明显增长,于24到48小时后出现体重轻于同窝野生型与杂合型乳鼠的现象。功能分析方面我和刘斌、吴齐辉(电生理)、王昌河(电镜)等同学的合作获得以下初步成果:3. Dynamin1KO三天龄乳鼠肾上腺新鲜组织切片柱状碳纤电极电化学纪录氧化电流较同窝野生型乳鼠增加47.24%。4. Dynamin1KO三天龄乳鼠肾上腺原代培养嗜铬细胞点状碳纤电极电化学纪录氧化电流幅度较同窝野生型乳鼠增加30%。且在半高宽不变的情况下,氧化信号峰面积积分随电流幅度增加变化。5. Dynamin1KO三天龄乳鼠肾上腺原代培养嗜铬细胞与野生型静息情况与恢复之后致密核心囊泡数量、直径无明显差异。6. Dynamin1KO三天龄乳鼠肾上腺原代培养嗜铬细胞经电容观察发现内吞极度减慢。综上,我们应用3-5天龄的Dynamin1敲除小鼠肾上腺嗜铬细胞实验发现,Dynamin1不仅对细胞内吞有作用,同时对细胞囊泡分泌也有贡献,而后者是通过控制融合小孔实现。
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