研究目的以GSK（Glycogen Synthase Kinase）-3β信号通路为研究靶点,开展血必净（Xuebijing injection,XBJ）对脓毒症肝损伤（Septic Acute Liver Injury,SALI）辨证为血瘀证的患者的治疗效果进行研究,探索阐明XBJ及单体成分之一的阿魏酸（Ferulic Acid,FA）对SALI的保护作用及其分子机制。研究方法1.临床试验采用随机号码表法对临床试验病例随机化分组,将纳入试验的60名SALI患者随机分为XBJ干预组30例和非XBJ干预组30例。两组均给予对应的抗感染方案和相关的脓毒症集束化治疗。XBJ干预组:在非XBJ干预组治疗的基础上,加用XBJ,具体用法:50ml/次,一天2次,静脉注射,疗程7天。主要观察指标:①中医血瘀证证候积分;②西医评分指标:APACHE-Ⅱ评分、SOFA评分;③肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase,AST）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AKP）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyl Transferase,γ-GT）、总胆红素（Total Bilirubin,TBIL）、白蛋白（Albumin,ALB）;④感染指标:白细胞计数（White Blood Cell count,WBC）、中性粒细胞百分比（Percentage of Neutrophils,N）、C反应蛋白（C Reactive Protein,CRP）、白介素（Interleukin,IL）-6、降钙素原（Procalcitonin,PCT）;⑤凝血指标:血小板计数（Platelet Count,PLT）、凝血酶原时间（Prothrombin Time,PT）、活化部分凝血活酶时间（Activates Partial Thromboplastin Time,APTT）、纤维蛋白原（Fibrinogen,FIB）、D-二聚体（D-Dimer,D-D）。2.网络药理学采用网络药理学分析XBJ治疗SALI的分子机制。首先构建XBJ小分子及相关靶蛋白数据集、SALI相关靶蛋白数据集、XBJ生物网络和XBJ靶蛋白互作网络,然后对XBJ靶蛋白功能和生物通路富集进行分析。3.基础实验研究3.1血必净部分动物实验:采用C57BL/6小鼠,将小鼠随机分为5组,每组小鼠18只。对照组（Con组）:进行假手术和生理盐水腹腔注射;模型组（CLP组）:进行盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture,CLP）手术加生理盐水腹腔注射;低剂量XBJ组（L-XBJ）:CLP手术+低剂量XBJ组（4ml/kg/d XBJ腹腔注射）;高剂量XBJ组（H-XBJ）:CLP手术+高剂量XBJ组（8ml/kg/d XBJ腹腔注射）;地塞米松组（Dexamethasone injection,DXM）:CLP 手术+DXM（5mg/kg/d DXM 腹腔注射）。XBJ干预实验持续5天,期间小鼠可以自由进食和饮水。除了接受假手术的对照组小鼠外,所有组的小鼠在所有干预结束后的第6天接受CLP手术。CLP手术结束后,各组小鼠分别于0、2、12h腹腔注射相应浓度的XBJ或DXM或生理盐水。第7天处死小鼠以获得肝组织和血清。检测各组的以下指标:①绘制各组小鼠的生存曲线;②对各组小鼠的肝脏进行组织学分析,观察肝组织的病理变化;③用免疫荧光法检测各组小鼠肝组织中的GSK-3β（Ser9）;④使用相应试剂盒检测肝组织中髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、ALT和AST的水平;⑤通过ELISA试剂盒检测血清中肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）,IL-6,IL-12,IL-1β和 IL-10 的水平;⑥通过 Western Blot 法检测各组小鼠肝组织中 GSK-3β（Ser9）、GSK-3β、核因子κB（Nuclear Factor kappa-B,NF-κB）、p-NF-κB、cAMP-反应元件结合蛋白（cAMP-Response Element-Binding protein,CREB）和p-CREB的表达。细胞实验:采用RAW264.7细胞,分为五组:对照组（Con组）:无药物处理;模型组（LPS组）:给予1μg/ml脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）;低浓度XBJ组（100-XBJ组）:用1μg/ml LPS和100倍稀释的XBJ处理;中浓度XBJ组（50-XBJ组）:用1μg/ml LPS和50倍稀释的XBJ处理;高浓度XBJ组（25-XBJ组）:用1μg/ml LPS和25倍稀释的XBJ处理。造模前给予不同浓度药物2h,然后对照组给予正常培养液,LPS模型组和XBJ处理组给予含1μg/ml LPS培养液。继续孵育24小时,然后进行后续实验。检测各组的以下指标:①测定各组细胞的活力;②用免疫荧光检测各组细胞中的GSK-3β（Ser9）;③使用相应试剂盒检测各组细胞上清液中IL-10、IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等炎症因子。④通过Western Blot 检测细胞中 GSK-3β（Ser9）、GSK-3β、p-NF-κB、NF-κB、CREB（Ser133）和CREB的表达。⑤使用过表达GSK-3β（Total）的慢病毒载体（LeGSK-3β）和阴性对照载体（LeCtrl）转染细胞,采用Western Blot检测p-NF-κB或CREB（ser133）的表达。同时采用免疫共沉淀法（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测p-NF-κB和CREB（ser133）与 CREB 的结合蛋白（CREB-Binding Protein,CBP）的结合率趋势。3.2阿魏酸部分动物实验:采用C57BL/6小鼠,将小鼠随机分为5组,每组小鼠18只。对照组（Con组）:进行假手术和生理盐水腹腔注射;模型组（ALI组）:进行CLP手术加生理盐水腹腔注射;低剂量FA组（6-FA组）:CLP手术+低剂量FA组（6ml/kg/d FA腹腔注射）;高剂量FA组（12-FA）:CLP手术+高剂量FA组（12ml/kg/d FA 腹腔注射）;DXM 组:CLP 手术+DXM（5mg/kg/d DXM 腹腔注射）。FA干预实验持续5天,期间小鼠可以自由进食和饮水。除了接受假手术的对照组小鼠外,所有组的小鼠在所有干预结束后的第6天接受CLP手术。CLP手术结束后,各组小鼠分别于0、2、12h腹腔注射相应浓度的FA或DXM或生理盐水。第7天处死小鼠以获得肝组织和血清。检测各组的以下指标:①绘制各组小鼠的生存曲线;②对各组小鼠的肝脏进行组织学分析,观察肝组织的病理变化;③用免疫荧光法检测各组小鼠肝组织中的GSK-3β（Ser9）;④使用相应试剂盒检测肝组织中MPO、ALT、AST的水平;⑤通过ELISA试剂盒检测血清中IL-10,TNF-α,IL-6,IL-12和IL-1 β的水平;⑥通过Western Blot法检测各组小鼠肝组织中 GSK-3β（Ser9）、GSK-3β、NF-κB、p-NF-κB、CREB 和 p-CREB 的表达。细胞实验:采用RAW264.7细胞,分为五组:对照组（Con组）:无药物处理;模型组（LPS组）:给予1μg/ml LPS;低浓度FA组（25-FA组）:用1μg/ml LPS 和 25μM FA 处理;中浓度 FA 组（50-FA 组）:用 1μg/ml LPS 和 50μM FA 处理;高浓度FA组（100-FA组）:用1μg/ml LPS和100μM FA处理。造模前给予不同浓度药物2h,然后对照组给予正常培养液,LPS模型组和FA处理组给予含1μg/ml LPS培养液。继续孵育24小时,然后进行后续实验。检测各组的以下指标:①测定各组细胞的活力;②用免疫荧光检测各组细胞中的GSK-3β（Ser9）;③使用相应试剂盒检测各组细胞上清液中IL-10、IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等炎症因子。④通过 Western Blot 检测细胞中 GSK-3β（Ser9）、GSK-3β、p-NF-κB、NF-κB、CREB（Ser133）和CREB的表达。⑤使用过表达GSK-3β（Total）的慢病毒载体（LeGSK-3β）和阴性对照载体（LeCtrl）转染细胞,采用Western Blot检测p-NF-κB或 CREB（ser133）的表达。同时采用 Co-IP 检测 p-NF-κB 和 CREB（ser133）与CBP的结合率趋势。研究结果1.临床试验①XBJ干预组与非XBJ干预组相比,中医证候疗效明显优于非XBJ干预组,差异有统计学意义（P＜0.05）。②两组患者治疗前后西医临床评分（APACHE Ⅱ评分、SOFA评分）的差异无统计学意义（P＞0.05）。③两组患者治疗7天后肝功能指标中,XBJ干预组的ALT、AST较前明显改善,差异有统计学意义（P＜0.05）,而其他几项肝功能相关指标（AKP、γ-GT、TBIL和ALB）两组治疗后差异无统计学意义（P＞0.05）。④两组患者治疗7天后感染相关指标中,XBJ干预组的PCT较前明显改善,差异有统计学意义（P＜0.05）,而其他几项感染相关指标（WBC、N、CRP、IL-6）两组治疗后差异无统计学意义（P＞0.05）。⑤两组患者治疗7天后凝血相关指标中,XBJ干预组的D-D较前明显改善,差异有统计学意义（P＜0.05）,而其他几项凝血相关指标（PLT、PT、APTT、FIB）两组治疗后差异无统计学意义（P＞0.05）。2.网络药理学通过对XBJ治疗SALI的分子机制的系统药理研究发现,槲皮素、木樨草素、黄芩素、丹参酮Ⅱa、隐丹参酮等9个化合物为其主要有效活性成分,通过靶向COX-2（PTGS2）、iNOS（NOS2）、ESR2、VEF-A、JUN、TNF、IFN γ、IL-2、IL-6等蛋白,调控TNF、PI3K-Akt、ERK1/2等通路调控炎症反应,达到治疗SALI的作用。3.实验研究3.1血必净部分动物实验提示:①肝脏形态学表明,XBJ减轻CLP诱导的C57BL/6小鼠的SALI;②XBJ改善SALI小鼠的肝功能指标;③XBJ调节CLP诱导的SALI小鼠血清中炎症因子的水平;④XBJ调节CLP所致SALI小鼠肝脏中GSK-3β、NF-κB和CREB的活性。细胞实验提示:①XBJ处理增加RAW264.7细胞的活力和GSK-3β（Ser9）表达;②XBJ调节LPS诱导的细胞炎症因子水平;③XBJ调节LPS诱导的细胞中GSK-3β、NF-κB和CREB的活性;④GSK-3β的过表达调节CBP与p-NF-κB和p-CREB的结合,XBJ通过影响GSK-3β信号通路调节CBP与p-NF-κB或p-CREB的结合率。3.2阿魏酸部分动物实验提示:①肝脏形态学表明,FA减轻CLP诱导的C57BL/6小鼠的SALI;②FA改善SALI小鼠的肝功能指标;③FA调节CLP诱导的SALI小鼠血清中炎症因子的水平;④FA调节CLP所致SALI小鼠肝脏中GSK-3β、NF-κB和CREB的活性。细胞实验提示:①FA处理增加RAW264.7细胞的活力和GSK-3β（Ser9）表达;②FA调节LPS诱导的细胞炎症因子水平;③FA调节LPS诱导的细胞中GSK-3β、NF-κB和CREB的活性;④GSK-3β的过表达调节CBP与p-NF-κB和p-CREB的结合,FA通过影响GSK-3β信号通路调节CBP与p-NF-κB或p-CREB的结合率。研究结论①临床研究表明,XBJ可以有效改善SALI辨证属血瘀证的患者的中医证候、肝功能指标（ALT、AST）、感染指标（PCT）和凝血指标（D-D）;②网络药理学研究发现,XBJ可能通过作用于TNF-α、IL-6、IL-10等核心靶点,干预PI3K-AKT-GSK-3β信号通路调控炎症,从而达到治疗SALI的作用。③实验研究表明,XBJ及FA通过GSK-3β/NF-κB/CREB信号通路抑制促炎细胞因子表达水平,促进抑炎细胞因子的表达,从而减轻CLP诱导的SALI小鼠肝损伤和LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症反应。