类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,在世界范围内平均患病率约1%,我国患病率约4‰;其突出的临床表现为关节肿、痛、僵硬和畸形;目前尚无有效的治疗方法,现行治疗的目标主要是减轻症状,预防关节破坏及功能丧失,提高生活质量。RA发病机制未明,其主要病理特征为成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）过度增殖、炎性细胞浸润及新生血管形成等;增生的滑膜组织构成血管翳侵蚀关节软骨和骨,造成关节进行性破坏、畸形和功能丧失等。因此,滑膜增生对类风湿性滑膜炎的发展起着重要作用。近期研究表明,细胞增殖与细胞死亡关系密切,RA FLS增殖与死亡也许存在不平衡,进而导致滑膜增生。因此,抑制RA FLS增殖,诱导其凋亡进而降低滑膜增生可成为治疗RA有效策略之一。弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant,FCA）诱导的佐剂性关节炎（adjuvantarthritis,AA）是一种实验性关节炎模型,其关节病理改变及细胞和体液免疫与RA相似,可用作评价RA治疗的测试系统。内抑素（endostatin）是一种强效内源性血管生成抑制因子,分子量为20kD左右,是胶原ⅩⅧ的降解产物,其抗血管生成活性机制可能是特异性抑制血管内皮细胞粘附、迁移和增殖,诱导其凋亡。近期研究证实,内抑素不仅可通过抑制内皮细胞功能（即抑制肿瘤新生血管形成）,而且还可通过直接抑制肿瘤细胞迁移、增殖及诱导其凋亡而发挥抗肿瘤效应。FLS是RA病理改变的最终靶细胞,其增殖活跃,具有肿瘤转化细胞的特征,RA滑膜组织类似于局限性侵袭生长的肿瘤,提示治疗肿瘤性疾病的途径可用于治疗RA,包括凋亡诱导因子和抗血管生成因子。目前有关endostatin的研究主要集中于抗肿瘤活性与机制等,而对其它病理性血管形成如慢性炎症性血管生成的影响国内外报道很少;以FLS为靶点,探讨endostatin对RA的作用及机制国内外尚未见报道。我们前期研究表明,腹部皮下注射重组人内抑素(recombinant human endostatin,rhEndostatin;(1.25,2.5,5.0 mg·kg^-1·d^-1,×7d)对大鼠AA有治疗作用,可明显减轻AA大鼠足爪肿胀程度,降低滑膜组织血管内皮（细胞）生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达,减小滑膜微血管密度（microvessel density,MVD）。进一步研究证实,rhEndostatin（3.125,6.25,12.5,25,50μg/ml）可直接抑制AA FLS增殖并诱导其凋亡,但具体作用机制不清楚。本研究正是在此基础上进一步探讨rhEndostain对AA FLS作用的潜在机制,为RA治疗及寻找其治疗新靶点提供实验依据。目的:①观察rhEndostatin对AA FLS细胞周期的影响;②观察rhEndostatin对AA FLS细胞周期相关基因p53,p21,CDK₄,cyclinD₁,PCNAmRNA和CyclinD₁,PCNA蛋白表达的影响;③观察rhEndostatin对AA FLS凋亡相关基因fas,bcl-2,c-fos,c-jun mRNA及c-Jun,NFκB,Caspase-3蛋白表达的影响;④观察rhEndostatin对AA FLS胞质游离钙(ionized free calcium,Ca²⁺)的影响。探讨rhEndostatin抑制AA FLS增殖,促进其凋亡的分子及离子机制,为RA药物治疗及寻找其治疗新靶点提供实验依据。方法:①AA大鼠模型制备:雄性SD大鼠,体质量140-160g,安徽医科大学实验动物中心提供,后足趾皮内注射FCA制备AA大鼠模型。②滑膜组织准备:大鼠随机均分为正常组、AA模型组、rhEndostatin（2.5mg/kg）治疗组和甲氨蝶呤(methotrexate,MTX;（1mg/kg）治疗对照组;后三组造模后第10-16天,rhEndostatin治疗组大鼠腹部皮下注射rhEndostatin(2.5 mg·kg^-1·d^-1),MTX组大鼠腹部皮下注射MTX（1 mg/kg twice weekly）,AA模型组及正常组大鼠给予等剂量的注射用水;第28天处死大鼠,取出滑膜层组织。③FLS准备:应用正常和AA大鼠膝关节新鲜滑膜组织进行细胞培养,实验用传2代培养的滑膜细胞,通过流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测AA大鼠滑膜细胞血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）表达情况鉴定FLS。④FLS细胞周期检测:传1代培养的正常和AA大鼠滑膜细胞接种于6孔培养板中,AA大鼠滑膜细胞分设AA模型组、rhEndostatin（50μg/ml）治疗组、MTX（1μg/ml）治疗组,用无血清的RPMI-1640培养液培养24h,使细胞周期同步化,继之换上含20%血清的RPMI-1640培养液,并相应加入rhEndostatin（终浓度50μg/ml）和MTX（终浓度1μg/ml）,继续培养48h后收集细胞,FCM检测细胞周期。⑤细胞周期相关基因检测:分别提取各组大鼠滑膜组织中RNA、蛋白质;实时荧光定量PCR法检测p53,p21,cyclinD₁,PCNA,CDK₄ mRNA表达;Western Blot法检测PCNA,CyclinD₁蛋白表达。⑥凋亡相关基因检测:实时荧光定量PCR法检测各组大鼠滑膜组织中fas,bcl-2,c-fos,c-jun mRNA表达;Western Blot法检测c-Jun,NFκB,Caspase-3蛋白表达。⑦AA FLS胞质Ca²⁺检测:Fluo-3/AM作为Ca²⁺指示剂,终浓度为50μg/ml rh-Endostatin灌流AA FLS,同时用激光共聚焦显微镜（confocal laser scanningmicroscope,CLSM）动态观察、记录AA FLS在有Ca²⁺液和无Ca²⁺液中胞质Ca²⁺荧光强度（fluorescence intensity,FI）变化,检测rhEndostatin对AA FLS胞质Ca²⁺浓度(cytosolic free calcium concentration,[Ca²⁺]_i)的影响。结果:①rhEndostatin对大鼠FLS细胞周期的影响:FCM检测和分析结果显示,正常组大鼠FLS细胞周期主要停留在G₀/G₁期,比例为68.3%,S期和G₂/M期细胞较少,分别为23.65%,6.32%;与正常组相比,AA模型组大鼠FLS G₁期比例明显减少,约为10.0%,大部分细胞进入S期,为65.6%,G₂/M期细胞比例接近19.5%;加入rhEndostatin（50μg/ml）后,G₁期细胞由AA模型组10.0%增至74.1%,而S期和G₂/M期细胞比例显著减少,分别为12.6%和4.15%。②rhEndostatin对AA大鼠滑膜组织中细胞周期相关基因表达的影响:实时荧光定量PCR检测结果显示,rhEndostatin（2.5 mg/kg）能显著降低AA大鼠滑膜组织中p53,p21,cyclinD₁和PCNA mRNA表达水平（P＜0.01）,增加CDK₄ mRNA表达（P＜0.01）。Western Blot检测证实,rhEndostatin治疗组大鼠滑膜组织中PCNA和CyclinD₁蛋白表达较AA模型组显著降低（P＜0.01）。③rhEndostatin对AA大鼠滑膜组织中凋亡相关基因表达的影响:实时荧光定量PCR分析结果表明,rhEndostatin（2.5mg/kg）能明显提高AA大鼠滑膜组织中fas,bcl-2,c-fos和c-jun mRNA表达水平（P＜0.01）。Western Blot检测进一步证实,应用rhEndostatin治疗后,大鼠滑膜组织中43kD和48kD c-Jun蛋白和Caspase-3 p20表达水平较AA模型组显著提高（P＜0.01）;但NFκB p65表达较AA模型组增加不明显（P＞0.05）。④rhEndostatin对AA FLS[Ca²⁺]_i的影响:CLSM检测结果显示,当细胞处于无Ca²⁺液中时,rhEndostatin（50μg/ml）不能引起AA FLS胞质Ca²⁺ FI的改变。当细胞外缓冲液为有Ca²⁺液时,终浓度为50μg/ml rhEndostatin灌流AA FLS可使胞质Ca²⁺FI急剧增加达峰值,随即荧光开始减弱,FI随时间缓慢下降。结论:①rhEndostatin抑制AA FLS增殖与其引起AA FLS细胞周期G₁期阻滞有关,其分子生物学基础可能是rhEndostatin抑制AA FLS CyclinD₁和PCNA的表达,并非依赖P53-P21-CDK-Cyclin经典途径。②rhEndostatin促进AA FLS凋亡与其增加AA FLS fas,c-fos,c-jun,caspase-3基因表达与活化有关,该凋亡过程不依赖于bcl-2表达降低,也不能被bcl-2表达增加和NFkB活化所抑制。③rhEndostatin可引起AA FLS胞外Ca²⁺内流,钙稳态失衡是rhEndostatin诱发AAFLS损伤的一个早期的事件,细胞内钙超载可能作为AA FLS凋亡的一个重要始动环节。