背景和目的:纳米氧化锌(ZnO NPs)是在工业、制药和日化等多个领域中使用最广泛的纳米材料之一。多项证据表明,ZnO NPs可能对心血管系统产生有害作用,线粒体是其重要攻击靶点,但对心脏的损伤效应及潜在机制有待阐明。线粒体生物合成(简称“线粒体生成”)是调节线粒体功能、对抗毒性损伤的重要机制。Fox O3a在维持心肌细胞氧化还原稳态,参与PGC-1α介导的线粒体生成,发挥着重要的调节作用。本研究旨在通过体外、体内实验观察ZnO NPs致心肌损伤的毒性作用特征,重点从线粒体生成和氧化应激调节角度阐明其作用机制,揭示Fox O3a-PGC-1α介导的线粒体生成在抗ZnO NPs致心肌毒性中的作用。以期通过本研究,为ZnO NPs的心脏安全性评估提供新证据,为纳米材料心毒性测试和安全性评价提供参考策略与方法。研究方法:1.采用透射电子显微镜和动态光散射法对ZnO NPs进行表征。2.选择人源心肌细胞系AC16作为研究模型,从细胞毒性、线粒体损伤以及线粒体生成信号通路三个层面,初步观察ZnO NPs致心肌损伤的毒性作用特征。通过检测细胞存活率和LDH漏出率,评价细胞毒性;通过高内涵成像分析检测ROS和MMP,通过荧光素酶法检测ATP水平,观察线粒体损伤;通过检测线粒体数量(HCA)、mt DNA拷贝数(RT-PCR)和PGC-1α通路蛋白(Western blot),观察线粒体生成的变化。进一步利用瞬时转染技术敲降Fox O3a,探讨毒性效应改变和其潜在的分子调控机制。3.选择hi PSC-CMs作为研究模型,该细胞具备人类心脏电生理和生物化学特性。进一步从体外确证ZnO NPs所导致的心肌损伤,重点观察其对线粒体生成的影响,并用微电极阵列技术研究了心脏电生理功能的改变。4.选择Fox O3a基因敲除的FVB小鼠作为研究模型。通过气管滴注暴露,以0.2 mg/kg和1.0 mg/kg的暴露剂量,每隔2日给药,共3次的方式,建立小鼠急性呼吸道暴露模型。通过检测常规血生化、心肌损伤酶、超声心动图、心肌组织病理和超微结构改变评价心肌损伤;通过检测心肌组织SOD活性、GSH和MDA含量,并检测Fox O3a-PGC-1α通路相关蛋白表达,从Fox O3a对氧化应激和线粒体生成功能调节的角度探讨其可能毒性机制。研究结果:1.TEM显示ZnO NPs呈球状和棒状,可被AC16细胞和hi PSC-CMs通过胞饮方式内吞。在水和培养基中的流体动力学直径分别为214.16±0.31 nm和266.27±27.36 nm,具有团聚特性。2.ZnO NPs呈剂量和时间依赖性对两种细胞产生心肌细胞毒性,在低细胞毒性暴露剂量下可引起线粒体损伤,表现为ROS蓄积和MMP下降。线粒体生成改变与ZnO NPs暴露剂量密切相关,较低暴露剂量(25,50μM,6 h)下可观察到线粒体生成活跃,主要表现为线粒体丰度、mt DNA拷贝数上升;较高暴露剂量下线粒体生成障碍。另外,在无明显细胞毒性暴露剂量下(50μM,2-6 h),观察到了hi PSC-CMs的心肌细胞电生理改变,主要表现为搏动率和去极化电位振幅的降低。3.Fox O3a对PGC-1α介导的线粒体生成具有直接调节作用,PGC-1α及TFAM表达先上调后下调,拐点在50μM 6 h。Fox O3a敲降后可加剧ZnO NPs所导致线粒体生成障碍、线粒体损伤和细胞毒性。4.经呼吸道暴露ZnO NPs后,可观察到小鼠心肌损伤,包括:外周血白细胞计数、中性粒细胞比例和甘油三脂升高;CK、CK-MB、HBDH和LDH心肌损伤酶呈剂量依赖性增高;高剂量组观察到了较为明显的组织病理改变和超微结构变化;超声心动结果表明,小鼠收缩末期左心室前壁和后壁显著增厚,心脏脏器系数显著升高,射血分数和短轴缩短率轻度降低(但无显著性差异);心肌组织GSH耗竭和MDA蓄积。5.与野生型小鼠相比,Fox O3a敲除小鼠表现出更加严重的心肌损伤。同等暴露剂量下,敲除小鼠心肌组织的GSH和MDA含量、左心室壁增厚程度和心肌损伤酶水平与野生型相比有显著性差异;通过病理切片和透射电镜观察,可观察到更严重的细胞结构改变和线粒体损伤。6.野生型小鼠心脏中Fox O3a-PGC-1α通路随ZnO NPs暴露持续激活,线粒体生成活跃;Fox O3a敲除小鼠心脏中PGC-1α通路蛋白呈低表达状态,线粒体生成受阻,线粒体损伤严重。研究结论1.ZnO NPs可诱导ROS生成增加,引起氧化应激和线粒体功能紊乱,最终导致心肌损伤。2.FoxO3a-PGC-1α信号通路在维持细胞氧化还原稳态、调节线粒体新生发挥了重要作用,敲降(敲除)Fox O3a后,心肌损伤加重。3.本研究在无明显细胞毒剂量下观察到了ZnO NPs可引起心肌细胞电生理改变,并且在低于职业暴露限值的剂量下发现了小鼠心肌损伤,提示低暴露剂量下ZnO NPs所导致的心血管损伤值得高度关注。4.将hiPSC-CMs模型与HCA、MEA等高通量检测技术结合,为纳米材料心肌毒性筛选和安全性评价提供有力技术方法。