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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)所致的丙型肝炎易于慢性化,是引起慢性肝病的主要原因之一。目前全球约有1.7亿HCV感染者。丙型肝炎与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关,严重危害人类健康,已成为全球性的、重要的公共卫生问题。迄今,HCV感染发病的机制尚不完全清楚,仍然缺乏有效的治疗方法,疫苗的研究也遇到很大障碍。HCV是一种有包膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科丙型肝炎病毒属。包膜病毒感染细胞的初始步骤即是病毒外膜与靶细胞膜结合并相互作用的过程,目前初步认为低密度脂蛋白受体(LDLR)、CD81、B族I型清道夫受体(SR-BI),claudin-1等多种宿主细胞膜分子参与其中,但由于一直以来都缺乏合适的研究模型,这些分子的角色认定尚缺乏有力证据,其具体作用机制也不十分清楚。而深入研究论证HCV入胞相关的宿主因子,有助于加深对HCV感染发病机制的理解,为抗病毒治疗寻找新的靶点。HCV进入细胞后,通过复制,合成,装配等过程最终释放出成熟的病毒颗粒。理论上完整的包膜病毒颗粒由核衣壳及外膜组成,但由于获取HCV颗粒存在一定困难且不同来源的病毒颗粒在大小和形态上存在显著差异,目前对HCV颗粒的超微形态结构尚无定论。因此,进一步了解HCV颗粒在感染细胞中的形态和分布特征及感染细胞自身结构的病理改变,有利于更加直观的认识病毒的生命周期及其在复制成熟过程中与哪些宿主细胞结构存在紧密联系,为寻找更有效抑制病毒感染的新途径提供依据。2005年Rockefeller大学HCV研究中心主任Charles M. Rice教授领导的实验室建立了HCV细胞培养系统,在一定程度解决了长期制约HCV研究的缺乏理想模型这一瓶颈问题。在Rice实验室的帮助和指导下,我们构建了丙型肝炎病毒体外细胞培养系统(HCV cell-culture system, HCVcc)。以此系统为平台,我们对HCV颗粒在感染细胞中的超微形态及感染细胞自身的病理改变进行观察研究,并进一步论证了CD81和SR-BI两种宿主表面分子在HCV感染中的重要作用。本实验主要完成了以下三个方面的工作:1 HCV细胞培养系统的建立与鉴定将Rice教授惠赠的含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh-7.5细胞,检测转染细胞中HCV mRNA及蛋白的表达,测定转染后细胞培养上清中的病毒数量;收获细胞培养上清孵育原始(na?ve)Huh-7.5细胞,测定并计算培养上清中HCV的感染性。实验结果显示:转染细胞内有HCV mRNA及蛋白表达,细胞培养上清中含有高水平的病毒拷贝数,感染性测定培养上清的TCID50/ml为6.98×104。结果表明成功建立了HCV体外细胞培养系统并获得有感染性的HCV。2 HCVcc感染原始(na?ve)Huh7.5细胞的透射电镜观察收获转染HCV RNA的细胞培养上清,与原始的Huh7.5细胞共孵育后制成超薄切片,透射电子显微镜观察感染细胞内HCV的形态结构和分布特征,以及宿主本身结构的变化。用专业软件测量观察到的HCV颗粒直径及病毒感染细胞前后的细胞内质网管腔内径,应用医学统计软件对测量数据进行分析。透射电子显微镜观察到HCVcc感染后的Huh7.5细胞胞质中含有大量的球形病毒样颗粒,直径在33-52nm之间,且多分布在核周的粗面内质网附近;感染细胞内部出现黄病毒科病毒感染后的特征性改变,如粗面内质网数量增加,管腔扩张,胞质中出现空泡结构和含有大量HCV颗粒的包涵体等。形态学的研究不仅进一步证明了HCV细胞培养系统的可靠性,也更加直观的显示了HCV颗粒在肝源细胞内的形态分布特征及其与内质网的密切联系。3 siRNA干扰CD81及SR-BI的表达对HCVcc易感性的影响使用化学合成的靶向CD81及SR-BI的siRNA序列分别转染Huh-7.5细胞,抑制Huh7.5细胞表面分子CD81或SR-BI的表达,检测转染前后Huh-7.5细胞对HCVcc易感性的变化。结果显示siRNA可有效的干扰CD81或SR-BI的表达,而CD81或SR-BI表达缺陷的Huh-7.5细胞对HCVcc的易感性明显下降,说明CD81和SR-BI都在HCV感染入胞过程中发挥了重要作用,是HCV感染的必要条件。