脑卒中是严重危害人类健康的常见疾病，具有高发病率、高死亡率及高致残率的特点。缺血性卒中是脑卒中的主要类型，约占所有卒中的75﹪<[1]>。神经元对缺血损伤高度敏感，致使卒中患者不可避免地发生神经元死亡。其神经元死亡导致的神经功能缺损，至今仍无有效的治疗措施，所以大多数卒中患者遗留有不同程度的后遗症。如何积极有效地促进缺血性脑卒中后神经功能的恢复是当前研究的重点之一。 神经颗粒素(neurogranin，NRGN)是由Watson等在1990年发现的一种含78个氨基酸的神经特异性蛋白质<[2]>，是蛋白激酶C(PKC)的突触后作用底物及钙调蛋白(CaM)结合蛋白。NRGN主要分布在皮质、海马、纹状体及杏仁体<[3]>，在亚细胞水平主要分布在神经元胞浆、树突及树突棘<[4]>。在新生大鼠NRGNmRNA表达、蛋白质合成的增加与神经元突触的形成、分化同步，提示NRGN与神经系统的发育密切相关<[2-3]>。在成年鼠前脑、海马等多个区域，NRGN一直维持在高表达状态，并发现其与正常神经功能的维持密切相<[5]>。脑外伤或大脑中动脉阻塞后在病变部位可见神经元胞体和树突内的NRGN免疫反应性的缺失，而病灶周围可见NRGN表达反应性增多，因此NRGN的表达可作为神经元胞体、树突损伤及再生的一个重要指标<[6-8]>。 生长相关蛋白(growth associated protein 43，GAP-43)是一种磷酸糖蛋白，与神经发育、轴突再生、突触重建密切相关<[3-11]>，是PKC的突触前作用底物及CaM结合蛋白。GAP-43及其mRNA广泛分布于大脑、小脑、脊髓、背根神经节以及自主神经系统的神经元内，在发育中的神经元， GAP-43伴随着轴突的生长在神经组织内大量合成，在生长锥表达尤其丰富<[11]>。成年时，大部分脑区GAP-43表达水平较低，新皮质、嗅球和海马以及脑干内的单胺类神经元GAP-43 mRNA一直保持在较高水平。损伤时，这些区域的神经元都表现为侧枝出芽和反应性轴突再生，并伴随着GAP-43表达增高<[10]>。这些都表明对于发育成熟的中枢神经系统，GAP-43的表达是评估轴突损伤和再生反应的一个重要指标。维甲酸(retinoic acid，RA)是一种维生素A(Vitamin A)的活性代谢产物。RA类物质在生物体的胚胎发育、器官形成、生殖、细胞分化和维持正常的生理稳态等方面都发挥着重要作用<[12、13]>。这些广泛的生理作用是以RA受体介导的，而这些存在于细胞核内的受体可与特异的DNA区域结合，从而调节其邻近的靶基因的表达，以此发挥RA类物质的瀑布式调节功能<[14]>。目前已知包括NRGNA、GAP-43mRNA在内的100多种基因受RA信号调节<[14-15]>。RA在中枢神经系统的正常发育过程起着非常重要的作用，在维持已发育成熟大脑的功能方面亦扮演着重要的角色<[16-18]>。 研究目的 本实验主要观察，脑梗死后梗死灶周围皮质不同时间点NRGN、NRGNmRNA及GAP-43、GAP-43mRNA的动态表达情况；腹腔注射RA对实验性脑梗死后神经功能恢复、梗死灶大小变化、脑梗死灶周围NRGN与GAP-43两种重要的突触再生反应指标表达的影响，试图找到一种能促进脑梗死后神经再生、突触重建的新方法，为临床脑卒中患者的治疗和康复提供可靠的理论依据。 研究方法 将体重280～320g雄性SD大鼠(Sprague Dawley Rats)216只，随机分成： (1)假手术组，(2)皮层梗死组+溶剂组， (3)皮层梗死组+维甲酸组，每组设有脑梗死后1天、3天、7天、14天、21天、28天六个时间观察点。用电凝法建立一侧大脑中动脉皮层支闭塞(MCAO)模型，后两组于术前12小时分别腹腔注射溶剂或维甲酸，MCAO术后每隔24小时注射一次，至断头取脑日，运用神经功能评分观察各组大鼠各时间点神经功能的恢复情况。断头取脑后行HE染色测定梗死灶大小，免疫组化检测各组大鼠不同时间点NRGN、GAP-43的表达情况，Real-time PCR检测各组大鼠不同时间点NRGNmRNA、GAP-43mRNA表达情况。 结果 1 神经功能评分假手术组大鼠未见神经功能缺损。MCAO+溶剂组与MCAO+RA组大鼠出现明显的神经功能缺损症状，主要表现为左前肢为重的偏瘫。MCAO+溶剂组术后1天、3天、7天、14天、21天大鼠神经功能评分明显低于假手术组(P<0.05)：MCAO+RA组术后1天、3天、7天、14天大鼠神经功能评分明显低于假手术组(P<0.05)；MCAO+RA组7天、14天神经功能评分较MCAO+溶剂组高(p<0.05)；MCAO+溶剂组与MCAO+RA组术后28天皮层梗死组大鼠神经功能得到改善，神经功能评分与假手术组比较无统计学意义(p>0.05)。 2 梗死灶体积假手术组HE染色未见梗死灶。MCAO+溶剂组与MCAO+RA组术后28天与1天、3天、7天、14天相比梗死灶体积明显减小(p<0.05)，MCAO+RA组脑梗死体积术后3天、7天、14天梗死灶体积与全脑体积比值较MCAO+溶剂组明显减小(P<0.05)。 3 脑梗死灶周围NRGN及NRGNmRNA的表达免疫组化结果显示：MCAO+溶剂组脑梗死灶周围NRGN的表达在脑梗死1天、3天明显增多，7天达高峰，之后逐渐下降，但各时间点NRGN的表达均较假手术组高(p<0.05)；MCAO+RA组3天、7天、14天、21天NRGN表达比MCAO+溶剂组明显增多(P<0.05)。Real-time PCR结果显示：MCAO+溶剂组脑梗死灶周围NRGNmRNA的表达在脑梗死后1天、3天急剧上升达高峰，之后表达开始逐渐下降，但各时间点NRGNmRNA的表达均较假手术组高(p<0.05)；MCAO+RA组1天、3天、7天、14天，21天NRGNmRNA表达H~MCAO+溶剂组明显增多(p<0.05)。 4 脑梗死灶周围GAP-43及GAP-43mRNA的表达免疫组化结果显示：MCAO+溶剂组脑梗死灶周围皮层GAP-43表达在脑梗死后1天、3天急剧上升，7天达高峰，14天、21天、28天表达逐渐下降，但各时间点GAP．43的表达均较假手术组高(p<0.05)；MCAO+RA组7天、14天、21天GAP-43表达比MCAO+溶剂组明显增多(P<0.05)。Real-time PCR结果显示：MCAO+溶剂组脑梗死灶周围皮层GAP-43mRNA表达在脑梗死1天、3天、7天急剧上升达高峰，14天、21天、28天表达逐渐下降，但各时间点GAP-43mRNA表达均较假手术组高(p<0.05)；MCAO+RA组1天、3天、7天、14天、21天GAP-43mRNA表达比MCAo+溶剂组明显增多(P<0.05)。结论1 脑梗死后，梗死灶周围神经元胞体，树突内NRGNmRNA表达3天达高峰，NRGN表达7天达高峰，随后逐渐降低，到第28天仍高于假手术组。因此推断脑缺血后首先是NRGNmRNA反应性的表达增高，进而促进NRGN蛋白的表达，提示NRGN参与了脑缺血后急性期内神经的再生与突触的重建。NRGN及NRGNmRNA表达的增长与衰减趋势，基本与神经功能恢复的快慢相一致，提示脑梗死灶周围NRGN的表达是神经功能恢复的一个重要促进因素。 2 腹腔注射RA，可限制MCAO大鼠的脑梗死体积的扩大，可促进MCAO大鼠神经功能恢复。无论对NRGN与GAP-43，无论在mRNA水平，还是蛋白水平，都明显的延长了两者的高表达时间，且同时伴有表达量的明显增高。因此腹腔注射RA，可促进脑缺血后神经再生，突触重建及神经功能的恢复。