羊口疮是由羊口疮病毒（orf virus,OrfV）感染山羊或绵羊所引发的一种传染性疾病,该病传染性强、发病率高,养羊场一旦发病即成爆发流行趋势,严重危害养羊产业的发展。羊口疮病毒为痘病毒科（Poxviridae）、副痘病毒属（Parapoxvirus）成员,是一种线性双链DNA病毒。B2L、F1L蛋白为羊口疮病毒的囊膜蛋白,其抗原性强、保守性较好,都能够诱导动物机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答,因此B2L、F1L蛋白成为了研究羊口疮病毒新型疫苗的靶蛋白。本研究截取B2L、F1L两个基因的最佳有效抗原片段,采用重叠延伸PCR技术进行融合,通过IPTG诱导表达B2L-F1L融合蛋白,以纯化的B2L-F1L融合蛋白作为包被抗原,建立一种基于羊口疮病毒B2L、F1L重组蛋白的间接ELISA方法,同时将纯化后的B2L-F1L融合蛋白免疫羔羊后检测其免疫指标,以评价B2L-F1L融合蛋白的免疫效果,为羊口疮亚单位疫苗的研制提供新方向。1.羊口疮病毒B2L、F1L截短融合基因的构建及生物信息学分析该研究旨在构建羊口疮病毒B2L-F1L融合基因,并对B2L-F1L融合基因序列进行生物信息学分析。采用DNAstar软件分别对B2L、F1L基因序列进行分析,截取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域,分别设计两对引物,利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术将截取的B2L、F1L基因主要抗原区域进行融合,并与p MD18-T载体进行连接,构建重组质粒p MD18-T-B2L-F1L,经质粒PCR、双酶切和测序验证正确后,应用生物信息学在线软件对其编码的蛋白进行信号肽、跨膜结构、亲水性、抗原指数、抗原决定簇、柔韧性、糖基化结合位点、磷酸化结合位点及二级结构和三级结构进行预测。结果显示,成功构建了B2L-F1L融合基因,大小约为1080 bp,与预期目的片段大小相符;预测该蛋白有信号肽、无跨膜结构域,亲水性、抗原指数及柔韧性较好,有17个抗原决定簇,2个糖基化和28个磷酸化结合位点,二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲占比较大。2.羊口疮病毒B2L、F1L截短融合蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备该试验旨在构建羊口疮病毒p ET-32a-B2L-F1L重组质粒,通过大肠杆菌表达B2L-F1L融合蛋白,并制备兔抗B2L-F1L融合蛋白多克隆抗体。将B2L-F1L融合基因与原核表达载体p ET-32a连接,经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,获得p ET-32a-B2L-F1L重组质粒,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,通过IPTG诱导表达B2L-F1L融合蛋白,并对蛋白的诱导表达进行条件优化,将获得的B2L-F1L融合蛋白经Ni柱纯化后,进行Western-Blot鉴定,将纯化后的B2L-F1L融合蛋白免疫两只新西兰大白兔,制备兔抗B2L-F1L融合蛋白多克隆抗体。结果显示,成功构建了p ET-32a-B2L-F1L重组质粒,融合蛋白表达最佳诱导温度为37℃、IPTG诱导终浓度为0.2 mmol/L,诱导时间为5 h,获得了B2L-F1L融合蛋白大小约为39 KD;Western-Blot结果显示B2L-F1L融合蛋白与羊口疮病毒阳性血清呈阳性反应;纯化的B2L-F1L融合蛋白免疫新西兰大白兔后,成功获得了兔抗B2L-F1L多克隆抗体,并通过ELISA方法检测兔1血清效价为1:419600,兔2血清效价为1:204800,Western-Blot分析表明,B2L-F1L融合蛋白能够与制备的兔抗多克隆抗体反应。结果表明,B2L-F1L融合蛋白具有免疫原性。3.基于羊口疮病毒B2L-F1L融合蛋白的间接ELISA方法的建立该试验旨在以纯化的B2L-F1L重组蛋白作为包被抗原,建立一种基于羊口疮病毒B2L、F1L融合蛋白的ELISA检测方法。采用方正滴定法对蛋白的包被浓度及血清稀释倍数、蛋白包被方式、脱脂奶粉封闭时间、一抗和酶标二抗孵育时间、酶标二抗稀释倍数、TMB显色时间、阴阳性临界值的确定等进行优化,通过敏感性、特异性及重复性试验对建立的ELISA方法进行评价。结果显示,融合蛋白最佳包被浓度为0.25μg/m L,最佳一抗稀释倍数为1:200,5%的脱脂奶粉封闭时间为1 h,一抗及酶标二抗最佳孵育时间为1 h,酶标二抗的最佳稀释倍数为1:8000,TMB最佳显色时间为15 min,确定阴阳性临界值为0.358,敏感性可达到1:512,与羊口蹄疫（A型、O型）、口蹄疫3ABC重组蛋白、羊支原体、小反刍兽疫、布鲁氏杆菌阳性血清反应结果均呈阴性;批内及批间重复性的变异系数均小于15%。结果表明,该试验基于羊口疮病毒B2L、F1L基因,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,这为羊口疮的快速鉴别诊断、免疫抗体监测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。4.羊口疮病毒B2L、F1L截短融合蛋白对羔羊的免疫原性研究该试验旨在为评价B2L-F1L融合蛋白对羔羊的免疫原性,分别设置B2L-F1L融合蛋白免疫组、羊口疮弱毒活疫苗组和生理盐水组,通过颈部皮下多点注射免疫1月龄羔羊,共免疫2次,后采用ELISA方法检测免疫不同时间段的羔羊血清中羊口疮病毒特异性抗体及IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6细胞因子的含量。结果显示,羊口疮弱毒活疫苗和B2L-F1L融合蛋白均能够刺激羔羊机体产生羊口疮病毒特异性抗体,B2L-F1L融合蛋白免疫组在第2周加强免疫后,抗体水平持续升高,在第4周略有降低,且在1～4周均极显著（P<0.01）高于弱毒活疫苗免疫组和生理盐水组,弱毒活疫苗免疫组在初次免疫后,1～4周羊口疮病毒特异性抗体都维持在同一水平,且极显著（P<0.01）高于生理盐水组;羊口疮弱毒活疫苗和B2L-F1L融合蛋白均能够刺激羔羊机体分泌IL-2,但含量较低,在第1周与生理盐水组差异性不显著,第2、3周羊口疮弱毒活疫苗免疫组显著（P<0.05）高于B2L-F1L融合蛋白免疫组和生理盐水组,在第4周极显著（P<0.01）高于生理盐水组,显著（P<0.05）高于B2L-F1L融合蛋白免疫组;B2L-F1L融合蛋白免疫组在第2周加强免疫后,IL-2分泌的含量在第3、4周持续上升,显著（P<0.05）高于生理盐水组;羊口疮弱毒活疫苗和B2L-F1L融合蛋白均能够刺激羔羊机体分泌IFN-γ,且在1～4周IFN-γ的含量都极显著（P<0.01）高于生理盐水组,羊口疮弱毒活疫苗与B2L-F1L融合蛋白免疫组相比,羊口疮弱毒活疫苗组在第1、2、4周IFN-γ的含量都显著（P<0.05）高于B2L-F1L融合蛋白组,第3周差异不显著;羊口疮弱毒活疫苗和B2L-F1L融合蛋白均能够刺激羔羊机体分泌IL-4,在1～4周分泌IL-4的量均显著（P<0.05）高于生理盐水组,而弱毒活疫苗组在初免后的第2周开始分泌IL-4,在2～4周显著（P<0.05）高于生理盐水组,B2L-F1L融合蛋白组与弱毒活疫苗组相比,B2L-F1L融合蛋白组在第1周显著（P<0.05）高于弱毒活疫苗组,在第2～4周差异不显著;羊口疮弱毒活疫苗和B2L-F1L融合蛋白均能够刺激羔羊机体分泌IL-6,在第2周显著（P<0.05）高于生理盐水组,但在第3周羊口疮弱毒活疫苗组、B2L-F1L融合蛋白组与生理盐水组差异不显著,在第4周B2L-F1L融合蛋白组显著（P<0.05）高于生理盐水组,但羊口疮弱毒活疫苗组与生理盐水组差异不显著。结果表明,B2L-F1L融合蛋白能够刺激羔羊机体发生体液免疫应答和细胞免疫应答。