目的:肺癌已是世界范围内病死率较高的恶性肿瘤之一。约80%的肺癌类型属于非小细胞肺癌（Non-smallcell lung cancer,NSCLC）,随着医学的发展,目前表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变的晚期非小细胞肺癌（Non—small cell lung cancer,NSCL）患者首选EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）靶向治疗己经取得了初步的疗效,主要使用的EGFR-TKI药物为吉非替尼（gefitinib）和厄罗替尼（erlotinib）,其中19号外显子缺失和21号外显子L858R点突变的晚期癌症患者对EGFR-TKI敏感,且取得了良好的疗效,但也因其局限的适用指征、原发和继发性耐药而阻碍治疗疗效。自噬是广泛存在于真核生物中的生命现象,细胞通过自噬能够去除受损的蛋白质和细胞器,产生的小分子物质能够被重新利用,以此来维持细胞内的功能和内环境稳定。在遭遇环境压力如饥饿、生长因子缺乏,能量需求增加或者药物刺激时,细胞内会迅速产生自噬机制,以此来抵抗外界环境或自身需求的改变。在许多肿瘤的相关研究中,自噬能够促进肿瘤的生长,维持肿瘤细胞内环境的稳定,为肿瘤细胞生长提供能量,促进了肿瘤细胞在化疗药物作用下的存活。许多研究表明EGFR-TKIs药物能够诱导自噬的发生。SIRT4是7种Sirtuins家族种的一员,具有ADP-核糖基转移酶活性,在线粒体种含量丰富。SIRT4被认为在DNA损伤应答反应中能够通过抑制线粒体谷氨酰胺的代谢而起到抑制肿瘤的作用。同时SIRT4能够抑制肿瘤细胞的有氧糖酵解,SIRT4过渡敏感的细胞更容易被糖酵解途径抑制剂诱导凋亡,同时SIRT4在多种肿瘤中起到抑癌作用。自噬过程也是需要细胞的能量代谢,而SIRT4在肿瘤细胞中的能量代谢发挥了重要作用,而EGFR-TKIs能够诱导肿瘤细胞产生自噬,因此我们的研究目的是证明SIRT4能够通过抑制EGFR-TKIs诱导的肺癌细胞自噬,进而提高了肺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性。为肺癌的临床治疗提供理论依据及可行性方法。研究方法:1.将肺癌细胞系H1299和HCC827按照购自公司中科院上海细胞库提供的配方及方法进行培养,待细胞状态良好且处于对数生长期,用胰酶消化进行重悬,适当密度铺于6孔板中,过夜待细胞充分贴壁,使用Lipo3000按照说明书要求向H1299细胞内转入SIRT4和空载质粒,向HCC827中转入SIRT4小干扰RNA和空白对照RNA,以调控SIRT4的过表达和低表达细胞在转染48和72小时后检测SIRT4表达情况以备用。2.Western blot检测自噬相关蛋白的表达情况。将生长状况良好的H1299和HCC827细胞以适当密度铺于6孔板中,进行相关的实验处理后,收集细胞,在含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂的NP-40哺乳动物蛋白提取试剂中裂解,然后以12000转离心20分钟。离心结束后收集细胞裂解液,测定细胞裂解液蛋白浓度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白（20-30μg）,并将蛋白转移到PVDF膜上,置于5%脱脂奶粉中封闭2h,然后将印迹与2%牛血清白蛋白/Tris-buffered saline Tween-20中的一抗在4℃的环境下孵育过夜后用二抗在室温下孵育两个小时,用ECL法检测相关蛋白信号。3.免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3B点的形成。将适量转染或干扰后的细胞铺于放有细胞爬片的24孔板中,待细胞充分贴壁,加入吉非替尼处理24h,经pbs清洗,4%多聚甲醛固定,0.5%Triton X打孔,山羊血清封闭2h,LC3B一抗过夜孵育,荧光二抗避光2h孵育,DAPI避光处理5min后封片,使用荧光显微镜进行观察。4.CCK-8法检测细胞在吉非替尼处理下的存活情况。将转染或干扰后的细胞分别适量铺于96孔板中,待细胞充分贴壁后使用不同浓度吉非替尼处理相同时间或使用相同浓度吉非替尼处理不同时间之后,每孔加入10μl CCK-8试剂,孵箱内避光孵育2h后使用酶标仪检测450nm吸光值,根据结果绘制生存曲线图。5.克隆形成实验检测细胞在吉非替尼作用下的增值能力。取生长状态良好的细胞进行转染和干扰操后,铺于六孔板中,每孔约1000个细胞,待细胞充分贴壁后加入适当浓度的吉非替尼作用48h,换成正常培养基继续培养12天,冰甲醇固定15min,结晶紫染色15min,用水冲洗,计数菌落。6.流式细胞仪检测细胞在吉非替尼作用下的凋亡情况,对细胞进行转染或干扰后,用对应浓度的吉非替尼作用24小时后,收集细胞,将北京四正柏公司生产的Annexin V10μl和PI 5μl试剂加入含有细胞的缓冲液（500μl）中,室温避光孵育15分钟。孵育结束后采用流式细胞仪检测。7.透射电镜实验。收集处理过的细胞后3%戊二醛固定4h,送到本校细胞生物学教研室电镜室进行观察。结果:1、Western blot结果显示与DMSO对照组相比,在不同浓度的吉非替尼作用下,随着药物浓度的增加,自噬相关蛋白LC3B的表达增强,p62的表达减弱,呈药物浓度依赖性。免疫荧光实验显示与DMSO对照组相比,在吉非替尼作用下能够观察到有明显的LC3B斑点形成。透射电镜观察到在与DMSO对照组相比,吉非替尼作用下的肺癌细胞中有自噬小体形成。CCK-8实验结果显示在自噬抑制剂3-MA和HCQ能够明显提高吉非替尼的药物毒性。2、Western blot结果显在吉非替尼作用下,与空载质粒对照组相比,转染SIRT4组中自噬相关蛋白表达减少,p62表达增加。与NC空白对照组相比,干扰SIRT4组中自噬相关蛋白LC3B表达增加,p62表达降低。免疫荧光实验显示,与空载质粒对照组相比,转染SIRT4组中LC3B斑点的形成减少。与NC空白对照组相比,干扰SIRT4组中LC3B斑点表达增加。透射电镜观察显示,在吉非替尼作用下与空载质粒对照组相比,转染SIRT4能够减少细胞中的自噬小体形成。3.CCK-8增值实验显示与空载质粒对照组相比,转染SIRT4能够增加吉非替尼的药物毒性作用。与NC空白对照组相比,干扰SIRT4能够减少吉非替尼的药物毒性作用。凋亡实验显示在吉非替尼作用下,与空载质粒对照组相比,转染SIRT4细胞的凋亡率增加。与NC空白对照组相比,干扰SIRT4细胞的凋亡率减少。克隆形成实验显示在吉非替尼作用下过表达SIRT4降低了细胞的集落形成能力。干扰SIRT4能够增强细胞集落形成能力,使用自噬抑制剂HCQ后能够逆转这一现象。4.Western blot结果显示,与DMSO对照组相比,在吉非替尼作用下,PI3K-AKT,MEK-ERK,信号通路活性增强,且SIRT4能够抑制吉非替尼诱导的MEK-ERK的活性。5.Western blot结果显示,与空载质粒对照组相比,转染SIRT4自噬相关蛋白ATG7表达减少,与NC空白对照组相比,干扰SIRT4自噬相关蛋白ATG7表达增加。与NC空白对照组相比,干扰ATG7,p-ERK的表达减少。结论:1、吉非替尼诱导肺癌细胞产生自噬。2、SIRT4能够抑制吉非替尼诱导的自噬。3、SIRT4增加肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。4、SIRT4抑制吉非替尼激活的MEK-ERK信号通路。5、SIRT4通过ATG7,p-ERK途径抑制自噬。