目的:随着口腔种植技术日渐成熟,种植牙已成为牙列缺损或牙列缺失患者的首选修复方式。然而,由炎症、外伤、解剖因素、先天性因素、废用性萎缩等原因造成的种植区局部骨量不足的现象非常普遍,很大程度限制了缺失牙患者对种植修复方式的选择。引导骨再生技术主要用于修复种植区局部骨缺损,引导骨再生屏障膜的选择是手术成功的关键。近年来,组织衍生的细胞外基质材料逐渐成为组织工程与再生医学领域的研究热点。细胞外基质材料的优势在于最大限度地去除具有免疫炎性的细胞成分的同时,最大程度地保留了组织内部的天然三维结构以及具有生物活性的细胞外基质成分,有助于组织更好的修复与再生。本研究选取了羊骨膜组织作为引导骨再生屏障膜的组织来源,1、探索并优化适用于羊骨膜组织脱细胞的方法,评价其组织脱细胞的效果以及细胞外基质结构与成分的保存情况。2、通过体外实验将小鼠MC3T3-E1细胞与脱细胞羊骨膜材料共培养,评价脱细胞羊骨膜材料对细胞黏附、增殖与成骨分化的作用。3、通过大鼠皮下植入的体内实验,探索脱细胞异种骨膜材料可能对宿主全身与局部产生的免疫炎性反应情况。4、通过建立兔颅骨骨缺损模型,进一步体内评价脱细胞羊骨膜材料对引导骨再生的作用。研究方法:1、联合应用物理法(反复冻融)、化学法(Triton X-100、SDS)、生物法(DNA酶和RNA酶)等脱细胞方法对羊骨膜组织进行脱细胞处理后,应用组织学切片HE染色和DAPI染色的方法确认组织中细胞的残留情况,提取羊骨膜组织中的DNA后进行定量测定其含量,应用琼脂糖凝胶电泳实验检测脱细胞羊骨膜材料中残留DNA的片段大小。利用羊α-Gal酶联免疫反应试剂盒定量检测脱细胞羊骨膜材料中α-Gal抗原表位的残留情况。制取脱细胞羊骨膜材料的浸提液,并检测浸提液中SDS的残留浓度。分别应用组织学切片Masson染色和番红O染色的方法评价脱细胞羊骨膜材料中胶原蛋白和糖胺聚糖的存留情况,并应用羟脯氨酸定量检测试剂盒和糖胺聚糖定量检测试剂盒定量分析脱细胞羊骨膜材料中胶原蛋白和糖胺聚糖的含量。利用扫描电子显微镜图像评价新鲜羊骨膜和脱细胞羊骨膜正反面的超微表面结构。吸水性实验用于评价脱细胞羊骨膜与新鲜羊骨膜吸水性的差异。机械力学性能试验主要用于评价脱细胞羊骨膜的各项机械力学性能指标。2、将小鼠MC3T3-E1细胞培养于不同浓度的脱细胞羊骨膜材料浸提液中,利用CCK-8实验评价脱细胞羊骨膜的对细胞增殖的影响。将小鼠MC3T3-E1细胞直接接种于脱细胞羊骨膜上,应用扫描电子显微镜与荧光显微镜评价小鼠MC3T3-E1细胞在脱细胞羊骨膜材料表面的黏附情况;采用碱性磷酸酶检测技术评价脱细胞羊骨膜材料对材料表面接种的成骨细胞早期分化的影响;利用聚合酶链式反应技术评价脱细胞羊骨膜材料对成骨细胞中ColI、Runx2、OCN表达情况的影响。分别将新鲜羊骨膜、脱细胞羊骨膜、Bio-gide商品膜材料随机植入SD大鼠的背部皮下,于术后3、7、14、28、56天时处死大鼠,采集大鼠血清应用酶联免疫分析方法测定其中IL-2、IFN-γ、IL-4的浓度以评价系统免疫炎性反应程度;获取皮下植入处局部组织并制作石蜡切片,行HE染色和CD 11b阳性细胞免疫组化染色以评价各组局部免疫炎性反应程度。3、建立兔颅骨缺损模型,于兔颅骨顶部中央制备4个8mm直径大小的全层骨缺损,设为4组:(1)对照组:骨缺损处无任何植入物;(2)P组:骨缺损处单纯覆盖脱细胞羊骨膜材料;(3)B组:骨缺损处单纯植入用取出的自体骨块研磨而成的自体骨颗粒;(4)B+P组:骨缺损处植入自体骨颗粒后覆盖脱细胞羊骨膜材料。待术后4、8、12周时取材,拍摄X射线片确认各组内部有无感染发生,应用Micro-CT观察各组成骨情况并定量分析骨缺损处新生骨体积百分比、平均骨小梁数量、平均骨小梁间距,制作各组局部组织的硬组织切片,行甲苯胺蓝染色,评价脱细胞羊骨膜的引导骨再生作用。结果:1、脱细胞骨膜HE染色和DAPI染色切片图像中均未见肉眼可见的细胞核成分,新鲜羊骨膜中DNA的含量为580.37±33.92ng/mg,而脱细胞骨膜中的DNA含量仅为32.52±5.31ng/mg,DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示,新鲜骨膜组呈现典型的全基因组条带形态,而脱细胞骨膜组未见明显DNA条带。α-Gal抗原表位的定量分析结果显示,新鲜骨膜组的α-Gal抗原表位含量为35.80±5.07ng/mg,而脱细胞骨膜组的α-Gal抗原表位含量仅为7.08±1.64 ng/mg,两者之间具有显著的统计学差异(p<0.05)。脱细胞骨膜所制备的浸提液中残留SDS的百分比为0.0025%,远远小于绝对安全剂量(0.005%)。Masson染色与番红O染色结果显示,脱细胞骨膜和新鲜骨膜细胞外基质中的主要成分——胶原纤维和糖胺聚糖的结构、排列分布与完整性方面无明显的差异,新鲜骨膜与脱细胞骨膜中的胶原蛋白含量(627.02±56.76μg/mg vs.609.91±38.15μg/mg)与糖胺聚糖含量(1.801±0.058μg/mg vs.1.748±0.038μg/mg)均无显著的统计学差异。相对比于新鲜骨膜,脱细胞骨膜的扫描电镜图像更为疏松多孔,但其中胶原纤维束的结构仍然完整地保留着。新鲜骨膜的吸水量为2.11±0.43mg/mg干重,而脱细胞骨膜的吸水量为3.41±0.34 mg/mg干重,两者之间具有显著的统计学差异(p<0.05)。脱细胞骨膜的弹性模量值(E=38.22±5.71MPa)小于新鲜骨膜的弹性模量值(E=45.89±3.27MPa)(p<0.05),但脱细胞骨膜的最大屈服应力值(39.11±0.90MPa)与新鲜骨膜(40.79±1.22MPa)之间无显著统计学差异。2、扫描电镜和荧光显微镜观察脱细胞羊骨膜上小鼠MC3T3-E1细胞均伸展良好,细胞从圆球形逐渐转变为梭形或多边形,最终相互交织成网,蔓延覆盖在整个脱细胞骨膜表面。CCK-8实验结果显示,在细胞培养的第5d和第7d,100%浓度浸提液组的细胞活性显著优于50%浓度的浸提液组,然后是25%浓度的浸提液组,100%浓度组与50%浓度组的OD值显著高于对照组(p<0.05)。培养在脱细胞骨膜表面的小鼠MC3T3-E1细胞的ALP活性均高于对照组细胞的ALP活性,其显著性差异主要出现在第3、7、10天时(p<0.05)。实时定量PCR结果表明脱细胞骨膜材料可以通过不同程度地促进COLI、Runx2、OCN的表达而促进小鼠MC3T3-E1细胞的成骨分化作用。在背部皮下植入的大鼠模型中,新鲜骨膜组7、14、28d时的血清IL-2和IFN-γ的表达均分别显著高于脱细胞骨膜组和Bio-Gide组的表达量(p<0.05),而IL-4的表达量在三组之间未见明显的统计学差异(p>0.05)。皮下植入局部HE染色和免疫组化染色结果见新鲜骨膜周围出现大面积的血管扩张和充血现象,存在大量炎性细胞的浸润,出现时间早且持续时间长,而脱细胞骨膜组和Bio-Gide组之间无明显差异,浸润的炎性细胞数量少且持续时间短。免疫组化切片定量分析结果显示新鲜骨膜组与其余两组在任意时间点均可见统计学差异。3、X线影像学观察四组在不同时间点均未发现感染迹象。Micro-CT扫描结果显示各组的新生骨量随时间的推移均有不同程度的增加。在不同的时间点中,都存在P组的新生骨量多于对照组,B+P组的新生骨量比B组的更多更致密的现象。在第8W和第12W时,P组和对照组之间的新生骨体积所占的百分比以及B+P组和B组之间骨缺损内部的骨体积所占的百分比出现了统计学的差异。第12W时P组的平均骨小梁数量显著大于对照组(p<0.05),其平均骨小梁间距则显著小于对照组(p<0.05)。甲苯胺蓝染色结果显示,对照组和B组均有不同程度纤维结缔组织长入的情况,而P组和B+P组的新生骨组织呈现出由脱细胞骨膜所引导的规则生长的形态,其表面光滑完整,且骨改建的速度优于另两组。结论:1、应用本研究改良后的脱细胞方法能够有效地去除脱细胞羊骨膜材料内的细胞成分,而且细胞外基质保留情况良好,脱细胞骨膜由于微观结构内部的孔隙较新鲜骨膜变大,使得脱细胞骨膜的吸水性增加,但其机械性能并没有受到显著影响。2、脱细胞羊骨膜具有良好的生物相容性,不仅能促进小鼠MC3T3-E1细胞的黏附、增殖与成骨分化,在异种植入时,也并不会引发严重的免疫炎性反应。3、脱细胞羊骨膜可以很好地保护骨缺损空隙中骨组织的生长而免受纤维结缔组织的干扰,同时具有促进骨组织生长的能力,能够很好的发挥引导骨再生的作用。