一、背景随着我国人们生活水平的提高及人口老龄化的加快,冠心病的发病率和死亡率呈迅速上升趋势,是中国居民死因构成中上升最快的疾病,已成为威胁中国公众健康的重要疾病,从而被称作是“人类的第一杀手”。现代医疗技术的进步,使冠心病的诊断和治疗有了长足的进步。静脉溶栓术、经皮冠状动脉腔内成形术、冠状动脉内支架置入术等血运重建技术广泛运用于临床后,冠心病急性心肌梗死的死亡率明显下降,但随之而来的心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)又成为威胁病人生命的重要因素。因此,探讨MI/RI的病理机制及研究有效的防治药物意义重大。MI/RI是指心肌血供在短时间中断的一定时间内恢复血供,原缺血心肌发生较血供恢复前更为严重的损伤。主要表现为再灌注心律失常、无复流、心肌顿抑、微循环障碍、甚至猝死等一系列病情反而恶化的现象。其病理过程复杂,涉及多个环节。过去对于MI/RI的基础和临床研究多集中在抑制氧自由基、拮抗心肌细胞内钙超载等方面,近来认为MI/RI主要是一种炎症反应过程,即以中性粒细胞(PMN)为主体,血小板、血管内皮细胞共同参与,在细胞因子、补体等多种生物活性物质共同作用下,由粘附分子介导的PMN与血管内皮细胞粘附向心肌浸润并释放大量氧自由基和酶类,在细胞、亚细胞甚至基因水平造成多种形式的损伤过程。研究表明,MI/RI时PMN的粘附、渗透、趋化、激活与穿内皮迁移,有赖于多种粘附分子和细胞因子,其中较有影响的是肿瘤坏死因子a(TNF-α)、白细胞介素-1(Interleakin-1, IL-1)、白细胞介素-6(Interleakin-6,IL-6)等。这些细胞因子能直接抑制心肌的收缩功能,导致心输出量下降,促发心肌细胞凋亡,直接和间接地增加PMN表面粘附分子CD11b及内皮细胞和心肌表面细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达。近年来,中医药在心血管疾病的防治上取得了很大的进展。祖国医学虽然没有MI/RI的概念,但从病因、临床表现、转归等特征来看,散见于中医“胸痹”、“心悸”、“厥心痛”、“脱证”等病的记载中。总病机可概括为本虚标实,本虚者,因禀赋不足,年迈肾衰,营血虚少引起心之阴阳、气血虚损,特别是心气虚和心阴虚,并根源于脾肾；标实者,系膏梁厚味、七情过激、劳逸失度、壅瘀生热产生之气滞、血瘀、痰浊、寒凝、热结,特别是痰瘀互结,阻遏胸阳,闭塞心络,痹而致痛。临床上多表现为虚实夹杂、相互转化。治疗原则以补益气血、调理阴阳、活血化瘀、化痰涤饮为主。中药复方定心方(DingXin Recipe, DXR)是我校临床治疗快速性心律失常的经验方,具有清心安神、益气活血之功效。前期实验研究发现定心方能明显减轻MI/RI,有效减少再灌注心律失常的发生。定心方主药丹参是含有多种活性成分的中药,临床广泛应用于心血管疾病的防治。其有效成分丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是其含量最高的脂溶性活性成分,对受损心肌有很好的保护作用。本课题组前期关于定心方防治MI/RI做了大量相关研究,但在炎症方面的机制研究涉猎较少。另外,前期蛋白质组学研究显示,抗增殖蛋白(Prohibitin,PHB)在MI/RI模型组和正常组间存在显著差异表达,与国外研究结果不谋而合。而且有研究证明,在肠上皮细胞炎症因子IL-6刺激能够增加PHB蛋白及mRNA水平的表达,并且能够诱发PHB启动因子激活,但在心肌方面的研究较少。二、目的本课题拟在以往研究基础之上,采用大鼠MI/RI动物模型,从心律失常评分和心肌病理两方面观察中药复方定心方及单体丹参酮ⅡA是否具有抑制MI/RT,发挥心脏保护作用；研究MI/RI大鼠血清中炎症因子IL-6及心肌组织中IL-6mRNA表达的变化及定心方及丹参酮ⅡA对其的影响；同时在蛋白质组学水平研究MI/RI大鼠PHB蛋白表达的变化及定心方和丹参酮ⅡA的干预作用；初步探讨在MI/RI中,炎症因子IL-6与PHB蛋白是否具有相关性。从而在动物水平上证实中药复方定心方和单体丹参酮ⅡA防治缺血性心脏病的可行性,为阐明MI/RI的发病机制、研制开发新型、安全的防治缺血性心脏病的中药制剂提供一定的实验依据。三、方法32只成年雄性Wistar大鼠随机分为4组,每组8只,分别为假手术组(sham operated group, SH组)、心肌缺血-再灌注组(myocardial ischemia-reperfusion group, MI/RI组)、定心方干预组(DingXin Recipe group, DXR组)及丹参酮ⅡA干预组(TanshinoneⅡA group, Tan组)。所有动物均适应性喂养7天。SH组、MI/RI组和Tan组均灌服生理盐水,DXR组灌服定心方药液,分上下午两次,连续灌胃7天后,MI/RI组、DXR组和Tan组手术造模,SH组冠脉只穿线但不结扎,Tan组术前尾静脉注射给药。根据《药理实验方法学》“麻醉大鼠冠脉结扎再松开法”改进并制作MI/RI动物模型。连接心电图机和心电示波器,观察心律失常的发生,详细记录再灌注期间的心律失常,并进行室性心律失常的量化评分,以评价再灌注损伤的程度；腹主动脉取血,分离血清；取心脏,冰生理盐水冲洗,分离左心室,一部分直接放入10%中性福尔马林溶液中固定,一部分放入-80℃冰箱中保存。左冠脉结扎和再灌注诱发的心律失常以室早(ventricular extrasystole, VE)、室速(ventricular tachycardia, VT)、室颤(ventricular fibrillation, VF)等室性心律失常(ventricular arrhythmia, VA)为主,故根据Cutis等创立的VA评分方法,进行室性心律失常评分。福尔马林溶液固定后的心肌组织常规石蜡包埋、切片。常规HE染色观察心肌组织形态学改变；观察缺血-再灌注损伤时心肌组织形态的变化及定心方和丹参酮ⅡA对其的保护作用。腹主动脉采血分离的血清,采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中IL-6的表达,观察定心方及丹参酮ⅡA对缺血-再灌注损伤大鼠血清IL-6表达的影响。部分心肌组织提取总RNA,反转录合成cDNA,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术(Real Time RT-PCR)检测IL-6mRNA的表达,观察定心方及丹参酮ⅡA对再灌注损伤大鼠IL-6mRNA表达的影响。部分心肌组织提取心肌组织蛋白,进行蛋白印迹实验。分别采用免疫印迹法及SABC免疫组化法检测心肌PHB蛋白的表达,观察缺血-再灌注损伤大鼠心肌PHB蛋白表达的变化及定心方及丹参酮ⅡA对其表达的影响。心律失常评分属于多组等级资料,采用完全随机设计资料的秩和检验(Kruskal-Wallis)方法进行分析,实验数据以平均秩次表示。其余数据属完全随机设计的计量资料,故采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法进行分析,方差齐时用Bonferroni法进行多重比较,方差不齐时采用Dunnett’s T3法,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,两个变量间的相关性分析采用Pearson相关性分析法。P<0.05表示差异具有统计学意义。采用SPSS13.0软件进行统计分析。四、结果1、定心方及丹参酮ⅡA对大鼠缺血-再灌注心律失常的影响。各组心律失常评分结果显示：VA评分分值由高到低依次为：MI/RI组、Tan组、DXR组、SH组。经统计学检验,有显著性差异(x2=22.360,P=0.000)。SH组大鼠偶见室性早搏,未见其它心律失常；MI/RI组大鼠8例均发生心律失常,多数大鼠冠脉再通1 min就开始出现,以频发室早、室速、室颤等为主,还有少量Ⅱ度及Ⅲ度房室传导阻滞,其中2例因室颤死亡,VA评分与SH组比较显著增高；DXR组8例也均出现心律失常,但以室早和室速为主,VA评分与MI/RI组相比显著减少；Tan组心律失常类型也以室早和室速为主,其中1例仅见偶尔的室性早搏,VA评分与MI/RI组相比也显著减少。2、定心方及丹参酮ⅡA对MI/RI大鼠心肌组织结构有良好的保护作用。HE染色光镜观察见：SH组大鼠心肌细胞排列整齐,着色均匀,胞膜完整,无变性、坏死、炎细胞浸润等改变；MI/RI组大鼠心肌细胞排列紊乱,着色不均匀,部分区域心肌细胞浊肿、坏死、大量炎细胞浸润；DXR组及Tan组大鼠亦有心肌细胞变性与坏死改变,但程度较轻,着色相对均匀,水肿变性减轻,心肌坏死范围较小。3、定心方及丹参酮ⅡA对MI/RI大鼠血清IL-6表达的影响。多组间比较有显著性差异(F=27.783, P=0.000)。MI/RI组大鼠血清IL-6的含量较SH组显著升高,差异有统计学意义(P=0.000)；定心方和丹参酮ⅡA干预组,血清IL-6含量均低于MI/RI组(P=0.001、0.004)而高于SH组(P=0.001、0.000)；定心方与丹参酮ⅡA两组间差异无统计学意义(P=1.000)。4、定心方及丹参酮ⅡA对MI/RI大鼠心肌组织IL-6mRNA表达的影响。多组间心肌组织IL-6mRNA表达有显著性差异(F=22.499, P=0.000)。MI/RI组大鼠组织IL-6mRNA的含量较SH组显著升高,差异有统计学意义(P=0.000)；定心方和丹参酮ⅡA干预组,IL-6mRNA含量低于MI/RI组(P=0.002、0.010)而高于SH组(P=0.002、0.000)；定心方与丹参酮ⅡA两组间差异无统计学意义(P=1.000)。5、定心方及丹参酮ⅡA对MI/RI大鼠心肌PHB蛋白表达的影响。采用蛋白印迹及免疫组化两种方法检测PHB蛋白表达结果趋于一致,多组心肌组织中PHB的表达有显著性差异(F=96.215、207.061, P=0.000)。MI/RI组PHB的表达较SH组升高,差异有统计学意义(P=0.000),定心方和丹参酮ⅡA干预组,PHB的表达显著高于MI/RI组,差异有统计学意义(P=0.000)；定心方与丹参酮ⅡA两组间差异无统计学意义(P=1.000、0.381)五、结论1、缺血-再灌注损伤容易诱发大鼠心律失常,定心方及丹参酮ⅡA可以显著减少心律失常的发生,减轻缺血-再灌注损伤的严重程度。2、定心方及丹参酮ⅡA对缺血-再灌注损伤大鼠心肌组织结构具有良好的保护作用。3、心肌缺血-再灌注损伤引起大鼠血清IL-6含量显著增高,定心方及丹参酮ⅡA可以显著减少IL-6的释放,减轻再灌注损伤程度。4、心肌缺血-再灌注损伤引起大鼠心肌组织IL-6mRNA表达显著增高,定心方及丹参酮ⅡA可以显著减少IL-6mRNA的表达。5、心肌缺血-再灌注损伤引起大鼠心肌组织PHB蛋白表达增高,定心方及丹参酮ⅡA可以显著增加PHB蛋白表达,对受损心肌具有保护作用。