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特发性肺间质纤维化(IPF)是一种进行性的、死亡率很高的一种慢性间质性肺疾病,其特点是肺泡上皮再生障碍、肺成纤维细胞或肌成纤维细胞(LFb/MFb)的增多积聚、细胞外基质的沉积、肺组织结构的扭曲,最终导致呼吸功能衰竭。实验中常以博莱霉素(BLM)致大鼠肺纤维化作为本病的动物实验模型。最近研究结果显示, 肺泡上皮细胞凋亡在肺纤维化的发生与发展中可能起非常重要的作用。在 BLM 作用下, 肺泡上皮细胞凋亡增多、Fas/Fas-L 通路被激活,导致 caspase-1 和 caspase-3 信号分子活化。由此可见,由 Fas/Fas-L、caspase-1 和 caspase-3 信号通路介导的肺泡上皮细胞凋亡与肺纤维化的发生与发展关系密切。另外,基膜的降解是肺组织损伤的标志,基质金属蛋白酶(MMPs)是一组重要的基膜降解蛋白酶,在基膜的损伤中扮演重要角色。在损伤因素持续存在的条件下,由于基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的合成和活性增加及/或 MMPs 的分泌和活性降低,使蛋白降解酶降解能力下降,使胶原合成与降解之间平衡被打破,最后引起 ECM 过多积聚和明显纤维化。本研究从整体、细胞与分子水平阐明复方鳖甲软肝方对肺纤维化过程中细胞凋亡及 MMPs 的影响。 整体实验:分为三个部分进行, 1. 气管内一次性注入 BLM 诱发大鼠肺损伤的动态变化及复方鳖甲软肝方防治作用的研究; 2. 复方鳖甲软肝方干预肺间质纤维化大鼠血清及肺泡灌洗液和肺组织匀浆明胶酶活性的实验研究; 3. BLM 致肺损伤大鼠肺泡灌洗液细胞凋亡的研究。 整体实验研究目的有三个方面:①探讨复方鳖甲软肝方的药效;②探讨 BLM 致大鼠肺纤维化明胶酶的发病机制;③探讨 BLM 致大鼠肺纤维化细胞凋亡机制。 结果显示:1. 支气管内注入 BLM 后一些功能性损伤发生在 28 天前。7 天模型组动物出现明显体重下降、低氧血症、肺泡表面活性物质(PS)系统活性异常,14 天逐渐好转,但仍然低于正常。14 天模型组肺组织羟脯氨酸含量显著高于正常,结合病理切片 Mallory 染色,证实 14 天纤维化病变就已形成。在 BLM 注入后 1-3 天,肺泡灌洗液(BALF)细胞总数增加,以中性粒细胞升高为主,14 天后转以巨噬细胞、淋巴细胞升高为主。中剂量组一定程度上缓解低氧血症及 PS 系统活性,并且通过抗炎效应使纤维化症状减轻。 2. 在 BLM 致大鼠肺损伤的 1-7 天,MMP-9 的活性升高占主要优势。模型组血清、肺组织匀浆及肺泡灌洗液样品中,MMP-9 活性均增加,在博莱霉素注入后 1 天开始升高,3 天达到高峰,7 天后开始回落,14 天、28 天已与假手术组无明显差异。从 14天开始,肺泡灌洗液样品中 MMP 2 的活性开始升高,持续到 28 天始终没有回落,肺2 复方鳖甲软肝方干预 BLM 致肺损伤大鼠细胞凋亡与 MMPs 活化机制的研究组织匀浆样品中 MMP 2 的活性升高较早,从第 3 天就开始升高,至 28 天始终没有回落。血清样品中则无明显MMP 2活性的升高。复方鳖甲软肝方中剂量组可以降低MMP9 活性,其可能的机制在于它的抗炎效应,但无显著的抑制 MMP 2 的作用。3. 7 天、14 天、28 天 BALF 中均无明显细胞凋亡和细胞增殖。体外实验研究:分四个部分进行,根据整体实验结果,离体实验均采用复方鳖甲软肝方中剂量组。1. BLM 致肺损伤大鼠早期肺泡巨噬细胞分泌明胶酶活性的体外实验研究;2. BLM 致肺损伤大鼠培养肺成纤维细胞活化机制的体外研究;3. BLM 致肺损伤大鼠培养肺泡 II 型上皮细胞凋亡的研究; 4. BLM 对培养大鼠肺泡 II 型上皮细胞功能损伤的研究。离体实验研究目的有两个方面:①深入研究 MMP 2 及 MMP 9 的细胞来源;②深入研究 AT II 细胞凋亡与肺间质纤维化的密切关系。结果显示:1. 模型组肺泡巨噬细胞在造模后 1、3、7 天 MMP 9 活性明显升高,ELISA 法定量测定 MMP 9 与对照组有显著差异(P<0.05) , 而 MMP2 和 TIMP1 三组比较无明显差异(P>0.05),中药中剂量组肺泡巨噬细胞分泌的明胶酶活性与模型组有显著差异,与对照组也有差异,说明复方鳖甲软肝方在一定程度上缓解了早期阶段基质金属蛋白酶对基膜的损伤。采用 0.1μg/mLBLM 直接刺激正常大鼠分离的肺泡巨噬细胞,发现 BLM 刺激组 MMP 9 的活性明显增加,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。10%的药物血清大中小剂量组都可以明显降低 MMP 9 的活性(P<0.05),由本实验推知 BLM 致肺纤维化大鼠 MMP 9 活性的升高与肺泡巨噬细胞和中性粒细胞的升高有关。当 MMP 9 被激活,导致基膜损伤或降解;2. 模型组LFb表达的CoI及α-SMA随着时间的延长显著增加,CoIII的表达却相反,至 28 天时明显低于 7 天组CoIII的表达(P<0.05)。将 0-0.5μg/mL浓度范围的BLM加入LFb培养液中,对LFb的生长、形态无明显影响,而在培养液中加入 0.1μg/mLTGF-β1,肺成纤维细胞增殖显著增加,免疫组化法检测CoI及α-SMA的表达增加,加入含药血清后,这种增殖速度明显降低。在检测各组LFb上清液中PGE2和IL-1β含量时,我们发现中药中剂量组PGE2大于对照组与模型组 10 倍(P<0.001),IL-1β也显著升高与模型组和假手术组比较P<0.05, 因此我们推测复方鳖甲软肝方可能通过刺激LFb自分泌PGE2和IL-1β来抑制自身的活化,从而减少胶原的沉积,缓解肺纤维化病变?