论文部分内容阅读
背景骨吸收刺激因素包括机械刺激、细胞因子和生长因子刺激等。目前普遍认为，骨吸收刺激因素对前体破骨细胞的诱导功能并不是直接作用于破骨细胞本身，而是通过作用于骨髓基质细胞，引起骨髓基质细胞表型改变，产生旁分泌作用于邻近的单核前体破骨细胞，使其进一步分化、融合成多核破骨细胞。骨髓基质细胞与前体破骨细胞的作用是体内破骨细胞形成、分化的必需条件。其中，骨髓基质细胞合成、分泌的两种因子在促进破骨细胞生成过程中起着关键性的作用，转录因子NF-kB受体活化剂配体（receptor activator of NF-KB ligand，RANKL）和另一种由成骨细胞及骨髓基质细胞分泌的可溶性细胞因子骨保护素（Osteoprotegerin OPG）。RANKL又称破骨细胞分化因子（osteoclast differentiation factor，ODF），是一种调节骨代谢的重要因子，主要表达在成骨细胞、骨髓基质细胞以及胸腺、淋巴结和脾组织中。RANKL能够促进破骨细胞的分化、成熟和活化。RANKL与破骨细胞前体上的肿瘤坏死因子超家族成员破骨细胞分化因子受体（ReceptorActivator of Nuclear Factor-kB RANK）膜蛋白结合，从而促进破骨细胞前体的分化和成熟而骨保护素（Osteoprotegerin OPG）能与RANKL竞争性结合RANK，阻止RANKL与RANK的结合。由此可见骨髓基质细胞在破骨细胞分化中的重要作用。机械应变是调控RANKL和OPG合成和分泌变化的一种重要的刺激因素。骨髓基质细胞是一种力学可兴奋细胞，体外实验已经证明，一定范围的机械力可以影响骨髓基质细胞的RANKL和OPG的表达，且表达的量与机械刺激的大小、频率、作用时间紧密相联。机械张力在250-2000με是可为骨组织的维持提供有效的生理性的刺激。当张力超过2500με时，虽然仍可刺激刺激骨形成，但是在这样的病理性负荷的作用下骨组织的破坏速度亦大大加快。研究目的1．本实验通过一种先进的体外细胞拉伸加力装置，对鼠骨髓基质原代细胞施加生理性及周期牵张力，观察细胞受力前后细胞形态及增殖活性的变化。2．对鼠骨髓基质原代细胞分别施加生理性周期性牵张力，观察RANKL和OPG基因的表达变化。材料和方法1．体外细胞加力装置及力学刺激细胞加力采用华中电子科技大学研制的四点弯曲细胞力学加载仪。该装置的原理是对弹性塑料板加力使之弯曲，从而使贴壁生长于板上的细胞受到相应的机械牵张力。将大鼠原代骨髓细胞接种到特制的塑料培养板上，继续培养24h，培养板上的细胞生长到80％汇合，将培养板放入加力皿内，在加力装置上进行加力。细胞所受的张力大小由弹性板的弯曲位移（mm）表示，位移越大，形变越大，表示细胞受牵张力越大。本研究加力频率为0.5Hz，位移为1.0mm，即张力为1785μ的生理性应力。2．原代骨髓基质细胞取材骨髓取自清洁级重120g左右雄性SD大鼠。颈椎脱臼法处死2只大鼠，将其完全浸没于75％酒精中，5分钟后取出置于无菌冰浴手术台上。分离并取出大鼠后肢双侧股骨和胫骨，去净附着的肌纤维，在超净台内剪去两端骨骺，用10ml针筒吸取完全培养基（含80％α-MEM，20％胎牛血清，100U／ml肝素），以不同方向冲洗骨髓腔共4次。细胞吹打均匀后接种于直径60mm的塑料培养皿，在37℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养。整个过程要求严格无菌、操作迅速。半小时后吸取细胞混悬液，按1×106／ml接种至细胞培养瓶中。每隔两天换液，逐步换去其它参杂的悬浮细胞。一般7-9天后细胞铺满底壁，以0.25％胰酶消化传代，反复传代法纯化鼠骨髓基质细胞，细胞传至第三代时备用。3．细胞加力将接近融合的第三代骨髓基质细胞按1×108／ml的密度接种在2×5cm2的塑料培养板上，分成六组。24h后细胞接近汇合时将细胞培养板置入四点弯曲细胞加力装置中。设置位移为1mm，频率为0.5hz的机械张应力。6组的加力时间分别为0h、1h、3h、6h、9h、12h。整个加力过程在无菌的加力皿中进行，加力装置放置在细胞培养箱中。4．RT-PCR检测机械力刺激下细胞RANKL、OPGmRNA的量的变化细胞在特制的培养板上生长到对数生长期时，加力位移1.0mm，频率0.5Hz、加力时间12h。加力过程中，分别在0h、1h、3h、6h、9h、12h这6个时间点收集加力后的细胞进行检测。各组平行重复3次，数据结果统计分析。结果1．原代鼠骨髓基质细胞：生长缓慢，大约培养7～9天后，细胞逐渐融合。细胞形态为纺锤形或成纤维样细胞，单核，核圆形或卵圆形，有集落样生长趋势。原代骨髓基质细胞经多次传代，混杂的血细胞减少，细胞类型趋向一致，排列更有序，呈现更活跃的增殖活动。2．RANKLmRAN随加力时间变化统计结果：显示自6h开始RANKLmRNA开始减少（34.4％），但6h、9h、12h之间没有显著差异。OPGmRAN随加力时间变化统计结果显示自9h开始OPGmRAN开始增加（73％），但9h、12h之间没有显著差异。结论1．原代细胞生长缓慢，在生长到第三代的时候生长状态最佳，适合加力。2．RT-PCR结果显示，生理性机械应力可以上调鼠骨髓基质细胞OPG基因的表达，同时降低RANKL基因的表达，提高OPG／RANKL的比率，继而起到抑制破骨细胞的分化、成熟和功能，使骨吸收降低，进一步证实生理性机械应力有抑制破骨细胞骨吸收的作用。