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中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹(以下简称河蟹),是一种重要的水产养殖品种。2015年,江苏省爆发了一种新型河蟹疾病—河蟹肝胰腺坏死综合症(Hepatopancreatic necrosis syndrome.HPNS),造成了严重的经济损失,在一定程度上制约了河蟹养殖业的发展。目前已明确河蟹成体中有HPNS发生,其相关的病理学、病因的研究已见部分报道,但其特定的病理变化和病因尚未明确,更无法进行针对性防治措施的研究。综上所述,河蟹HPNS研究尚处于初级阶段,且研究对象主要为成蟹,而苗种中是否发生HPNS鲜有报道,更未见其病因的研究报道。本文拟通过流行病学调查、病理学观察和微生物组学分析,以了解河蟹苗种中HPNS的发病情况,并对其病因和发病机制进行初步探讨。本文研究内容具体分为以下3部分:1.河蟹苗种中的HPNS的流行病学调查为了解HPNS在河蟹苗种中的发病情况,进行了江苏地区河蟹苗种中的HPNS的流行病学调查。结果显示,2017～2018年期间,HPNS出现在河蟹苗种的幼蟹中,但在大眼幼体和仔蟹中均未出现。发病时,发病规模较小,发病率和死亡率较低,同池的其他甲壳类无HPNS症状;主要发病时间为5～7月;仅发生在江苏兴化和丹阳地区的个别养殖塘口。HPNS病蟹表现为活力减弱、摄食量减少、耐低氧能力减弱。解剖发现其肝胰腺白化、甚至萎缩:鳃组织发黑:腹腔中有大量积水。初步的致病因素筛查结果显示,发病区域的养殖池水温度、pH、氨氮含量、硫化氢含量等水质理化因子均在河蟹正常生长的耐受范围内:在苗种病原携带情况方面,大眼幼体中未见携带甲壳动物常见病原,如白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal&haematopoietic necrosis virus,IHHNV)、中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)以及河蟹微抱子虫(Hepatospora eriocheir);仔蟹中出现较低的IHHNV阳性检出率;幼蟹中有较高的WSSV、IHHNV阳性检出率:HPNS病蟹中未检出螺原体和微孢子虫,但部分批次HPNS发病池的幼蟹中,WSSV、IHHNV 阳性检出率较高,分别高达86.67%和26.67%,尤其是HPNS病蟹体内出现同时携带IHHNV和WSSV的情况。在可培养细菌的数量与组成方面,HPNS病蟹肝胰腺中可培养细菌的数量与健康蟹无显著性差异,但优势菌群发生变化,气单胞菌属(Aeromonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)成为优势菌。以上结果表明.河蟹苗种的幼蟹中有HPNS发生,但发病规模较小,发病率和死亡率较低,且HPNS的发生具有物种特异性。初步认为河蟹苗种中HPNS的发生与水质理化因子无显著性关联,但可能与苗种携带病原具有一定的关联。2.HPNS患病苗种的病理学研究为了对苗种中HPNS的病因进行初步探讨,通过组织病理学和细胞病理学观察技术,对HPNS患病苗种的肝胰腺进行了病理学观察。结果显示,在光镜下,可见病蟹肝胰腺肝小管出现空泡样变性,分泌细胞(B细胞)和吸收细胞(R细胞)数量减少,基膜破裂,上皮细胞大量坏死脱落。电镜下可见病蟹肝细胞出现严重的空泡样变性;细胞核变形,染色质边集,核膜裂解,线粒体内嵴减少或消失,整体空泡化;溶酶体含量显著增加。结果表明,HPNS病蟹肝胰腺发生明显的病理变化,其正常的生理功能减弱。并且发生的病理变化常见于病毒感染其他水生动物,初步推论,河蟹苗种中HPNS的发生可能与苗种携带病原具有一定的关联。3.河蟹苗种中HPNS的肝胰腺菌群的初步探究为进一步探究河蟹苗种中HPNS的病因和发病机制,利用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对以下五组河蟹的肝胰腺菌群结构进行研究:健康蟹、HPNS病蟹、只携带WssV河蟹、只携带IHHNV河蟹以及同时携带IHHNV和WSSV河蟹。研究结果显示,在肝胰腺菌群多样性方面,与健康蟹组相比,HPNS病蟹组的肝胰腺菌群多样性降低。在部分菌属的相对丰度的变化上,与健康蟹组相比,HPNS病蟹组和其余3组携带病原组的肝胰腺菌群中气单胞菌属、假单胞菌属等致病菌属的丰度增加、与肝胰腺颜色相关、含有类胡萝卜素的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)等有益菌的丰度减少。在菌群相似性方面,HPNS病蟹组与同时携带IHHNV和WSSV河蟹组首先聚类(相似度0.72),随后依次与只携带IHHNV河蟹组(相似度0.69)及只携带WssV河蟹组(相似度0.62)聚类,最后与健康蟹组聚类(相似度0.56),表明HPNS病蟹组的肝胰腺菌群结构与同时携带IHHNV和WsSV河蟹组的较为一致,与健康蟹组的差异明显。以上研究结果表明,HPNS病蟹肝胰腺菌群多样性的降低和菌群相对丰度的改变引发肝胰腺生理功能下降,继而出现HPNS,初步推测菌群发生变化的原因可能与携带病原,尤其是同时携带IHHINV和WSSV有关。此外,本研究发观,HPNS病蟹组中未发现豆科植物中常见的慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),而其余4组中慢生根瘤菌属为优势菌,表明HPNS病蟹已经长时间停止报食行为,其余4组蟹仍正常摄食,初步认为,在养殖条件下,由于幼蟹同时携带IHHNV和WSSV,导致肝胰腺的生理机能下降,继而停止摄食,随后逐渐发展形成HPNS。综合以上研究结果,可以明确河蟹苗种的幼蟹中有HPNS发生,但发病规模较小,发病率和死亡率较低,且HPNS的发生具有物种特异性。初步推论河蟹苗种中HPNS的发生可能与同时携借事HHNV和WSSV有关,同时携带IHHNV和WSSV导致肝胰腺正常的生理功能下降,继而停止摄食,随后逐渐发展形成HPNS。