目的 多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiform,GBM）作为中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）内原发性的恶性脑肿瘤,患者5年生存率低于10%,中位生存期仅为15个月。FDA批准的疗法包括手术切除、化疗和放疗。胶质母细胞瘤的侵袭性,加之其病灶位于大脑使得手术难以全部切除病变组织。血脑屏障（Blood-Brain Barrier,BBB）的存在限制了化疗的疗效,使得大部分药物难以到达病灶。化学动力学疗法（Chemodynamic Therapy,CDT）是一种介导活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）产生的策略,通过芬顿反应（Fenton-type Reactions）将 H2O2转化为高细胞毒性的羟基自由基（·OH）进而诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的治疗带来了新希望。然而,CDT的相关纳米制剂大多基于金属-有机骨架（Metal-OrganicFramework,MOF）材料,其具有不可避免的神经毒性,再加上肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）中高浓度的谷胱甘肽（Glutathione,GSH）,过氧化氢浓度不足等问题限制了其疗效。因此,我们初步设想增强肿瘤区域H2O2的浓度与耗竭 GSH。葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase,Gox）在肿瘤部位催化葡萄糖、O2和H2O产生葡萄糖酸与H2O2。此外,这一过程在消耗O2和葡萄糖的同时,也造成了肿瘤区域乏氧。肿瘤细胞一般利用糖酵解方式来为自身提供能量,即便在O2存在的情况下也是如此,这被称之为Warburg效应。根据Warburg效应,肿瘤细胞需要更多的葡萄糖来功能。Gox消耗葡萄糖,切断肿瘤细胞的能量来源进而实现癌症的饥饿疗法（Cancer Starvation Therapy,CST）。然而,Gox易被体内清除,酶活性低阻碍了其临床治疗应用。如何高效率穿透BBB,保持Gox活性的同时缓解肿瘤区域的乏氧还有待探索。固有免疫在机体防御中发挥着重要作用。STING（Stimulator of Interferon Genes）作为固有免疫通路中的重要一环,其可以被环GAMP合成酶（cyclic GMP-AMP Synthase.cGAS）通过双链DNA（dsDNA）激活,也可以被其他小分子激动剂在特定条件下激活,从而产生释放干扰素（Interferon,IFN）等多种炎性相关细胞因子,引发固有免疫应答。肿瘤细胞内的STING相关的免疫应答反应可以抑制肿瘤的发展。Mn2+作为机体所必需的微量元素在肿瘤免疫治疗领域大显身手。Mn2+即使在没有dsDNA时候也可以结合并激活cGAS的功能,增强cGAS-STING的结合亲和力。且Mn2+也是类芬顿反应的引发剂,催化H2O2转化为·OH。同时其具有类过氧化物酶活性,可以与H2O2生成O2,缓解肿瘤区域的乏氧。聚多巴胺（Polydopamine,PDA）由多巴胺进行氧化自聚所产生,其与天然贻贝类似,具备儿茶酚类结构,可以通过金属-配位,π-π共轭和自身粘附性包裹在几乎任何物体的表面上形成“纳米衣”。良好的生物相容性使得其广泛应用于生物医学,纳米材料等领域。此外,PDA的GSH耗竭和酸响应特性提示我们可以将之应用于递送葡萄糖氧化酶以此增强CDT的效率,减小副作用,助力癌症饥饿疗法,化学动力学疗法和免疫疗法的联合。基于细胞膜的智能仿生纳米药物递送策略是最近研究的热点之一。Zhang提出在纳米粒表面包裹红细胞膜借此逃逸吞噬细胞的清除。细胞膜包裹具有天然的优势,如癌细胞膜包载纳米载体就可以实现同源靶向以达到精准递送的目的。黑色素瘤具有脑转移的特性,故B16F10细胞膜具备先天跨越血脑屏障的优势。我们采用B16F10细胞膜包裹以穿透血脑屏障使得纳米粒能够有效的聚集在肿瘤部位。综上所述,我们设计了一种共载葡萄糖氧化酶,Mn2+和聚多巴胺的黑色素瘤细胞膜仿生纳米递送体系。该多功能纳米递送体系利用黑色素瘤细胞膜靶向性跨越BBB,富集于肿瘤病灶,在高浓度GSH和弱酸性的pH作用下,聚多巴胺坍塌释放出Gox和Mn2+。Gox消耗葡萄糖的同时产生H2O2,Mn2+介导类芬顿反应产生·OH诱导细胞凋亡。此外,Mn2+和H2O2产生氧气改善乏氧的同时激活STING通路,多模式多手段抑制肿瘤的发展。方法 1.以Gox为模板,采用静电吸附和迈克尔加成反应共载Mn2+以及聚多巴胺并进行B16F10细胞膜仿生修饰,制备GMPC。2.利用马尔文激光粒度仪测量纳米粒子的水合粒径与Zeta电位,透射电镜观察形态,X射线光电子能谱分析元素组成。3.通过pH计测量GMPC在葡萄糖溶液中的pH值以验证其催化生成葡萄糖酸。4.利用全波长扫描紫外可见分光光度计对GMPC体外生成H2O2和·OH,耗竭GSH的能力进行考察。5.CCK-8试剂盒测定GMPC对于肿瘤细胞毒性和生物相容性。6.利用流式细胞术通过Annexin V-PI试剂盒测定凋亡比例,倒置荧光显微镜观察各处理组的ROS生成情况。7.Western Blot 法检测 GMPC 处理后 STING、HIF-α 和 Caspase-3 的表达水平。8.采用倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜测定钙网蛋白（Calreticulin,CRT）易位,高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein B1,HMGB1）释放,线粒体膜电位下降和DNA氧化损伤。9.多功能酶标仪测定ROS相关指标:胞内H2O2水平,GSH含量,脂质过氧化丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平,总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力。10.建立GL261脑胶质瘤原位荷瘤小鼠模型,尾静脉注射GMPC,小动物活体成像系统追踪GMPC不同时刻的分布情况并对离体器官的荧光强度进行定量分析。11.尾静脉注射GMPC治疗荷瘤小鼠,治疗期间检测生存期和体重变化。活体成像分析脑部位的荧光强度变化。同时,对组织切片进行免疫组化染色。结果 1.制得仿生GMPC,马尔文激光粒度仪测得其水合粒径约为186 nm,Zeta电位为-25.1 mv较GM电位下降,透射电镜表明其形貌为球形,核壳结构明显,表面有一层细胞膜包覆。X射线光电子能谱分析表明其由C、N、O、Mn和P元素构成。2.pH计结果表明GMPC和葡萄糖溶液共孵育,溶液的pH呈现不断下降趋势。3.紫外吸收光谱显示GMPC组在420 nm处的吸光度值增加且在600-900 nm处有三个较宽的吸收峰,表明H2O2的生成。660 nm处吸光度的降低表明亚甲基蓝（MB）降解掉生成的·OH。GMPC组较GM组在660 nm处的吸光度低说明了 GMPC可以消耗GSH,提高·OH的生成水平,避免被GSH清除。4.CCK-8实验表明在相同条件下GMPC 比GM有着更高的对肿瘤细胞的抑制能力,加入L-抗坏血酸细胞活力增加表明抗肿瘤作用来源于诱导的氧化应激。对于正常细胞的安全性考察显示其具有很好的生物相容性。5.ROS检测实验说明GMPC可以诱导活性氧的生成（活性氧生成比例占43.5%）,凋亡实验亦显示GMPC组诱导肿瘤细胞凋亡率最高。6.GMPC 诱导STING蛋白表达水平上调,说明其中包载的Mn2+可以激活STING通路。此外,GMPC处理过后肿瘤细胞的Caspase-3和HIF-α分别上调和下调,这说明GMPC能够诱导凋亡和改善肿瘤细胞乏氧状况。7.GMPC诱导肿瘤细胞氧化应激,出现CRT易位,HMGB1释放,线粒体膜电位下降和DNA损伤。8.GMPC处理细胞后,ROS相关的一系列指标发生了变化:胞内H2O2含量上升,GSH水平下调,MDA含量升高,T-AOC下降和SOD活力升高。9.利用原位荷瘤小鼠进行脑部靶向能力的考察,活体成像结果表明GMPC处理后,可以聚集到脑部的肿瘤部位且离体器官成像结果同样映证了 GMPC具备良好的脑部靶向能力。10.体内实验显示GMPC拥有良好的肿瘤抑制能力,生存期明显延长且GMPC治疗组小鼠体重变化不大。活体成像实验表明GMPC治疗后,肿瘤相较于其他组荧光强度低且生化血液指标测定揭示其具有优异的生物相容性。结论 1.GMPC具备pH响应性,GSH耗竭性和对葡萄糖的敏感性,在TME中释放所包载的各个组分。体外实验证实其可以产生·OH,耗竭GSH增加类芬顿反应效率的同时降低HIF-α的表达,产生O2缓解乏氧状况。2.GMPC通过生成的·OH诱导肿瘤细胞凋亡的同时造成了细胞内的氧化应激,引起肿瘤细胞CRT易位,HMGB1释放,DNA氧化损伤,ROS相关指标的改变和线粒体膜电位下降。GMPC消耗葡萄糖,切断癌细胞的能量供应。此外,Mn2+也发挥了激活STING通路的作用,诱导STING蛋白上调。3.GMPC拥有脑部肿瘤靶向的能力,尾静脉注60 h后脑部仍具有较强的荧光信号。离体器官的成像结果也印证了其可以有效聚焦于脑部器官。4.GMPC治疗组小鼠生存时间明显延长且体重未发生较大的改变。其安全无毒具备良好的生物相容性,三法协同有望成为脑部肿瘤治疗的新策略。