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目的小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）是一种神经内分泌肿瘤,在所有肺癌类型中占比约15%。早期症状不明显、倍增速度快、高侵袭性是小细胞肺癌的主要特点。大约60%的患者在初次诊断时已出现远处转移,其中脑部是小细胞肺癌患者常见的转移部位。脑部放疗能有效降低小细胞肺癌脑转移的发生率,但对于治疗脑转移作用十分有限。化疗治疗小细胞肺癌的主要手段,但由于血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的存在,限制了药物进入脑转移病灶部位发挥药效。因此,亟需开发能高效跨越BBB,并特异性靶向病灶部位肿瘤细胞的药物递送系统。铜（copper,Cu）不仅是人体必需的微量金属元素,也是多种酶的辅助因子,参与多种生理和病理过程。体内铜的含量依赖于一个复杂网络进行调控。当细胞内铜浓度升高时,位于反式高尔基体网络（trans-golgi network,TGN）的铜转运蛋白ATP7a和ATP7b定位到质膜,促进铜的外排。同时ATP7a为体内多种铜依赖性代谢酶提供酶促反应所需的铜离子,其功能的丧失会导致细胞内铜含量的升高,氧化还原稳态失衡,进而影响铜依赖酶活性和线粒体功能。赖氨酸氧化酶（lysyl oxidase,LOX）作为铜依赖性单胺氧化酶,参与多种癌症转移。有研究表明ATP7a沉默可以抑制LOX活性,启动一系列级联反应,进而抑制肿瘤细胞转移和生长。因此ATP7a可以作为潜在治疗靶点。基于以上背景,我们设计合成了一种肿瘤微环境响应型铜基纳米材料,利用其装载靶向沉默 ATP7a 的 siRNA（small interference RNA,siRNA）,并进一步将上述体系包封于脑靶向肽修饰的干细胞膜中,构建了 TP-M-Cu-MOF/siATP7a纳米药物递送系统用于治疗肺癌脑转移。该递药体系在干细胞膜和TP0751多肽的双重作用下,实现跨越血脑屏障并靶向至脑部肿瘤区域,在肿瘤微环境作用下释放siATP7a,一方面它可以抑制LOX活性,抑制肿瘤转移,另一方面可以抑制铜离子外排,增加胞内铜的蓄积。此外,体系释放的铜离子通过类芬顿反应产生具有细胞毒性的羟基自由基,诱导增强氧化应激,实现协同起效抗肿瘤效果。因此,该研究为开发多功能纳米系统提供了新策略,为小细胞肺癌脑转移靶向治疗提供了新思路。方法1.以人源小细胞肺癌细胞系H69细胞为主要研究模型,合成靶向人源ATP7a的siRNA序列,通过Western Blot检测siRNA-ATP7a对ATP7a的沉默效果。2.合成制备TP-M-Cu-MOF/siATP7a过程:第一步,通过一步水热法合成Cu-MOF,利用其多孔特性负载siATP7a,获得Cu-MOF/siATP7a并进行红外光谱的表征;第二步,通过物理共挤出法将修饰了 TP0751靶向肽的干细胞细胞膜包被于Cu-MOF/siATP7a表面,获得TP-M-Cu-MOF/siATP7a,观察其形貌并进行粒径和电位的表征。3.通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜考察H69细胞对各组载基因纳米粒的摄取效率,以及纳米粒在细胞的定位。4.通过q-PCR和Western Blot实验考察各组载基因纳米粒对H69细胞中ATP7a表达的沉默效果。通过电感耦合等离子质谱考察靶向沉默ATP7a对细胞铜离子含量影响。5.利用电子自旋共振波谱仪考察Cu-MOF的体外ROS生成能力。通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜考察TP-M-Cu-MOF/siATP7a在H69细胞中的ROS产生能力。6.通过CCK8检测TP-M-Cu-MOF/siATP7a对H69细胞增殖能力的影响。7.通过Annexin V/PI双染色法考察TP-M-Cu-MOF/siATP7a对H69细胞凋亡率的影响,同时通过 Western Blot 实验检测 Bax、Bcl-2、Bcl-x1、Mcl-1 和 cleaved caspase 3等凋亡相关分子的表达。8.通过激光共聚焦显微镜考察TP-M-Cu-MOF/siATP7a对H69细胞线粒体膜电位影响。通过Western blot实验考察细胞色素C在亚细胞器中的定位,9.通过Transwell实考察TP-M-Cu-MOF/siATP7a对H69细胞迁移能力的影响;通过Western Blot实验检测H69细胞中FAK和Src磷酸化水平、LOX和EMT相关标志物的表达情况。10.通过q-PCR实验检测靶向沉默ATP7a对铜代谢通路相关基因的表达影响。11.通过小动物活体成像技术考察TP-M-Cu-MOF/siATP7a的体内靶向性。建立小细胞肺癌脑转移小鼠模型,尾静脉注射纳米粒,观察不同给药治疗之后小鼠肿瘤生长情况。通过TUNEL法检测小鼠肿瘤组织细胞的凋亡情况。结果1.与对照组和其他处理组相比,siATP7a-2对H69细胞中ATP7a蛋白沉默效果最佳,我们选用这条序列用于后续实验。2.成功构建了 TP-M-Cu-MOF/siATP7a。TEM结果显示纳米粒为球形。3.TP-M-Cu-MOF/siATP7a可高效递送siRNA到H69细胞并实现溶酶体逃逸。4.TP-M-Cu-MOF/siATP7a能有效沉默H69细胞中ATP7a的表达。单独沉默ATP7a或单独使用TP-M-Cu-MOF处理可以增加细胞内铜离子含量,TP-M-Cu-MOF/siATP7a处理后含量升高更为显著。5.Cu-MOF可以高效产生羟基自由基。TP-M-Cu-MOF/siATP7a消耗肿瘤细胞内高含量的GSH,通过类芬顿反应生成ROS。6.TP-M-Cu-MOF/siATP7a对正常细胞HBE没有显著毒性,但其抑制H69细胞增殖能力相较于单独使用siATP7a或Cu-MOF效果更强,。7.TP-M-Cu-MOF/siATP7a诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡相关分子Bcl-2、Bcl-x1和Mcl-1的表达明显下调,Bax和cleaved caspase 3表达上调。8.TP-M-Cu-MOF/siATP7a诱导H69细胞线粒体损伤,进而导致线粒体膜电位下降,释放细胞色素C进入胞质。9.TP-M-Cu-MOF/siATP7a抑制H69细胞LOX活性、FAK和Src磷酸化,上调E-cadherin蛋白表达和下调Snail蛋白表达。10.沉默ATP7a可以下调细胞中SOD、CTR1和COX等基因的表达水平。11.成功建立小细胞肺癌脑转移小鼠模型,TP-M-Cu-MOF/siATP7a具有较好的脑靶向性,能够有效抑制肿瘤生长,诱导肿瘤组织发生凋亡。结论1.成功制备了一种仿生纳米递药体系TP-M-Cu-MOF/siATP7a,其可以被肿瘤细胞高效摄取,实现有效的基因沉默效果。2.TP-M-Cu-MOF/siATP7a可以产生高细胞毒性的ROS,抑制小细胞肺癌细胞增殖,以及诱导肿瘤细胞凋亡。3.TP-M-Cu-MOF/siATP7a通过沉默ATP7a不仅能降低LOX活性,进而抑制肿瘤细胞EMT过程,最终抑制肿瘤细胞转移,还可以影响铜代谢通路相关基因表达水平。4.TP-M-Cu-MOF/siATP7a具有脑靶向性并有效抑制肿瘤生长,为肺癌脑转移的治疗提供新策略。