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背景唐氏综合征(Down’s syndrome,DS)是最常见的染色体疾病和出生缺陷,其多余的一条21号染色体阻碍了儿童的生长发育,并且造成严重的神经功能缺陷。DS患者的神经功能缺陷不仅会造成认知能力的丢失,还能导致早发性老年性痴呆的发生。因此,加强DS神经缺陷的研究,对延缓其脑损伤、改善认知能力、提高生活质量具有重大的意义。细胞凋亡在神经系统疾病中发挥重要作用。DS是一种类似于老年性痴呆(Alzheimer disease,AD)的神经退行性病变,目前细胞凋亡对DS发生的影响尚未有定论。本研究从蛋白组学入手,筛选DS小鼠海马差异蛋白的表达,通过差异蛋白的生物信息学分析挑选出关键的蛋白分子,从组织学与细胞学角度探讨该分子与神经元凋亡的关系。本研究将有助于阐明DS神经功能缺损的分子机制。目的(1)以Ts65Dn小鼠作为DS模型,采用iTRAQ技术筛选鉴定其海马组织中的差异蛋白表达,为深入研究DS神经缺陷的分子机制奠定基础；(2)运用生物学信息学分析,明确差异蛋白的性状及其相互作用,揭示差异蛋白与DS神经缺陷发生发展的关联性；(3)明确DS海马神经元的凋亡状态,初步证实Akt蛋白异常表达与DS神经细胞凋亡的关系,进一步验证蛋白组学结果。方法(1)Ts65Dn小鼠传代繁殖：用Ts65Dn小鼠作为DS模型,雌雄合笼繁殖子代,以第一代小鼠(16～18周)作为本研究对象。按照Jackson Laboratory推荐采用分子生物学方法检测小鼠17号染色体GRCm38.p1突变进行子鼠品系的鉴定。(2)应用iTRAQ技术筛选DS小鼠海马组织的差异蛋白：收集小鼠海马组织,采用蛋白电泳、蛋白质谱的方法进行预实验,证实样本蛋白含量符合要求。在此基础上采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白电泳,之后进行酶解和肽段定量；采用iTRAQ 4标试剂盒进行肽段标记；经毛细管高效液相色谱分离后进行质谱分析；采用Mascot 2.2软件进行数据库检索及鉴定,采用Proteome Discoverer1.3软件对肽段报告离子峰强度值进行定量分析。(3)差异蛋白的生物信息学分析：针对iTRAQ技术在Ts65Dn小鼠海马组织中筛选鉴定到的374个差异蛋白,分别采用GO功能分析和富集分析、KEGG通路分析、Network网络分析、Hub蛋白分析等方法,阐明筹异蛋白的理化特性和生物信息学特征。(4)Akt蛋白在Ts65Dn小鼠神经元凋亡中的作用研究：收集海马组织,采用透射电镜直接观察Ts65Dn小鼠海马组织神经元凋亡的形态学改变；采用TUNEL方法观察Ts65Dn小鼠海马神经元的凋亡比率；分别采用免疫组化技术与Western blot技术观察Ts65Dn小鼠海马组织Akt蛋白及其磷酸化(p-Akt)的表达；从新生Ts65Dn小鼠脑组织分离培养神经干细胞,进一步诱导分化为神经元细胞；采用LY294002抑制Akt蛋白磷酸活化,阻断PI3K/Akt通路,采用流式细胞术检测神经细胞凋亡的情况,初步证实Akt蛋白的异常表达与Ts65Dn小鼠神经细胞凋亡的关系。结果(1)Ts65Dn母鼠交配繁殖后,第一代子鼠存活17只,按照Jackson Laboratory推荐的基因型鉴定方法进行型别鉴定。采用iTRAQ技术,经Mascot查库和Proteome Discoverer定量分析,Ts65Dn小鼠海马组织中共筛选鉴定到2805种蛋白质。通过与正常小鼠比较进行显著性分析并计算其显著性指数,共鉴定到显著性表达差异的蛋白共374个,其中显著升高的蛋白有195个,表达显著降低的有179个。(2)利用生物信息学方法对差异蛋白进分析。其中GO分析发现：分子功能类别以结合蛋白(334,89.3%)、催化活性的蛋白质(102,27.3%)和转移酶蛋白质(39,10.4%)数量最多；生物学途径以细胞途径(238,63.6%)、生物调节途径(149,39.8%)和代谢途径(148,39.6%)为主；细胞学组件大多数是细胞质、胞外区、细胞膜成分。KEGG分析Ts65Dn小鼠海马中374个差异蛋白共有143个蛋白质对应到144个不同的KEGG通路,经FDR矫正取P<0.05统计分析, Akt蛋白所在通路显著性富集。(3)Ts65Dn小鼠海马组织神经元出现不同程度的凋亡改变。透射电镜发现神经元出现凋亡改变,核膜变薄并轻度下陷、染色体分布不均、核呈固缩性改变、细胞壁凹陷等。TUNEL结果显示Ts65Dn小鼠海马组织神经元凋亡的阳性表现为细胞浆、细胞核呈棕黄色,与正常小鼠相比,神经元凋亡率显著增加。(4)免疫组化与Western blot结果发现：Ts65Dn与正常小鼠中枢神经组织锥体细胞均有Akt蛋白的表达,与正常小鼠相比,Ts65Dn小鼠中Akt蛋白显著增高,p-Akt蛋白的表达也显著增强。从新生Ts65Dn小鼠脑组织成功分离培养出神经干细胞,进一步诱导分化为神经元,加入LY294002抑制剂培养48h后,Akt磷酸活化被抑制,p-Akt蛋白表达明显降低,神经元凋亡率有降低的趋势。结论(1)采用蛋白组学iTRAQ技术筛选发现与正常小鼠相比,Ts65Dn小鼠海马组织存在大量差异表达的蛋白(374个),可能与神经缺陷相关。(2)利用生物信息学方法从多个不同的角度分析Ts65Dn小鼠海马组织差异蛋白的特点、相互作用及其参与的信号转导,初步揭示了差异蛋白与DS神经缺陷的相关性。(3)Ts65Dn小鼠海马组织神经元呈现出高凋亡状态,同时在DS小鼠海马组织及离体培养的神经元中Akt蛋白异常表达,且与神经元凋亡密切相关。