两种生态型拟南芥响应内质网胁迫差异的蛋白质组学及其分子机制研究

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植物在生长发育过程中可能遭遇各种不利环境,在高温等逆境条件和种子储藏物质累积等特定发育阶段,植物细胞内质网(ER)积累大量未折叠和错误折叠蛋白,从而造成内质网胁迫(ER stress)。内质网胁迫引发了一种称为未折叠蛋白应答(UPR)的保守过程,它的触发引起了蛋白质折叠、囊泡运输和内质网关联的蛋白质降解(ERAD)的下游基因表达的变化。模式植物拟南芥在全球各地分布有上千种生态型,但不同生态型对内质网胁迫的敏感性是否不一样还未见报道。虽然拟南芥内质网胁迫应答中的转录组动态响应和一些关键转录调节因子比如bZIP28/bZIP60已被发现,但内质网胁迫诱导的蛋白质组变化在拟南芥中尚未见报道。在本文的研究中发现拟南芥Landsberg erecta(Ler)生态型较Columbia(Col)生态型对内质网胁迫更加敏感。我们采用了TMT同位素标签定量蛋白质组学分析,从Col和Ler幼苗中分别鉴定到7439和7035个蛋白质,其中88和113个蛋白质分别受到内质网胁迫的差异调节(FC>1.3或<0.77,P<0.05)。40个蛋白在Col和Ler中共同上调,10个蛋白在bzip28 bzip60双突变体(Col背景)中未上调。与Ler相比,在Col特异性上调的19个蛋白中,ERAD、蛋白质N-糖基化、囊泡运输和分子伴侣中的成分都有所涉及。RT-q PCR的结果显示,在Col生态型中特异上调的19个蛋白质中有8个蛋白质对应的基因表达没有在内质网胁迫后上调;而在两种生态型中,另外11个蛋白质对应的基因表达在内质网胁迫后上调表达(FC>2,P<0.05)。但是这19个蛋白质对应的基因表达在Col和Ler之间的上调表达倍数没有显著差异。相较于Col生态型,Ler生态型的一个重要特征是类受体激酶ERECTA基因功能的缺失。本文通过表型分析发现Col背景下的ERECTA突变体(er105)具有内质网胁迫诱导剂衣霉素(TM)敏感表型,说明类受体激酶ERECTA的功能差异可能造成了拟南芥Col和Ler幼苗之间TM敏感性的差异。随后,我们获取Col特异上调蛋白OS9、EBS7和TGA6对应的过表达植物,对蛋白质组部分数据进行了验证。免疫印迹实验证实,Col背景下ERAD有关的OS9-FLAG蛋白水平受到TM诱导上调倍数远高于Ler和er105(Col背景)背景下的OS9-FLAG蛋白水平上调程度。随后使用蛋白酶体抑制剂MG132处理发现这种生态型间的差异消失。结合无细胞体系(cell-free)降解实验,可以证明两种生态型中OS9蛋白质丰度在内质网胁迫条件下受到了严格调控,Col生态型中的OS9蛋白具有更高的稳定性。ERAD有关的EBS7-FLAG蛋白在TM处理前后的蛋白水平不存在差异,我们认为该蛋白在TM处理前后的丰度差异主要由其对应的基因表达水平差异引起的。同时我们发现Col和Ler两种生态型间EBS7蛋白序列存在9个氨基酸位点变异,这有可能是两种生态型间蛋白质差异积累的原因之一。转录因子TGA6的基因表达在两种生态型中都不受TM诱导上调,但Col背景下TGA6-Flag蛋白丰度在TM处理后诱导上调,Ler背景下没有差异。结合无细胞体系降解实验结果,可以认为Col生态型中的TGA6蛋白具有更高的稳定性。另外,表型分析发现在Ler生态型背景下过表达OS9、EBS7和TGA6基因都可以增强Ler生态型的TM抗性。综上所述,本论文发现Col和Ler两种拟南芥生态型内质网胁迫敏感性存在差异,通过蛋白质组学分析进一步发现这两种生态型在蛋白质组水平上对内质网胁迫有不同响应,探究了两种生态型之间内质网胁迫下差异积累的原因,揭示了类受体激酶ERECTA、ERAD相关蛋白OS9和EBS7以及转录因子TGA6对两种不同生态型中内质网胁迫敏感性差异的重要调控作用。
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