目的：　　本课题组在前期研究中已发现，作为外源性CO的供源，CORM-3应用于炎症因子诱导的人牙龈成纤维(HGF)细胞时能够抑制其黏附分子的表达，抑制免疫活性细胞向牙周组织黏附、浸润和深部迁移，从而减轻宿主的炎性病理反应。前期研究结果提示我们CORM-3的应用可为牙周病的治疗提供了一种极具潜力的方法。基于以上研究背景，我们以人牙周膜成纤维细胞作为体外实验模型，以LPS和尼古丁共同刺激来模拟吸烟的牙周炎患者的牙周组织局部微环境，研究CORM-3对人牙周膜成纤维细胞的毒性、增殖和凋亡的影响，以及在炎性环境中对牙周膜成纤维细胞炎性因子和破骨细胞因子表达的调控作用，同时探讨HO-1通路是否参与CORM-3对上述因子表达的调控。　　方法：　　第一部分 CORM-3对人牙周膜成纤维细胞的毒性、增殖和炎症环境下抑制细胞凋亡的影响　　取新鲜拔除的恒牙，用组织块法分离并培养原代人牙周膜成纤维细胞，鉴定细胞来源，取状态良好的第4～6代细胞用于各项试验。采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)测定不同浓度(0、100、200、400、800μM)CORM-3对HPDLF细胞的毒性作用;以浓度为0、100、200、400μM的CORM-3刺激细胞，分别于0，24，48，72，96小时用CCK-8法检测细胞活性，评价CORM-3对HPDLF细胞增值的影响。　　建立LPS和尼古丁刺激下HPDLF细胞炎症模型，采用Annexin V-FITC/PⅠ双染法、应用流式细胞术检测工作浓度的CORM-3是否抑制炎症环境下HPDLF细胞凋亡。　　第二部分 CORM-3抑制LPS和尼古丁诱导的人牙周膜成纤维细胞炎症因子及破骨细胞因子表达的作用及其机制　　（一）CORM-3对LPS和尼古丁诱导的人牙周膜成纤维细胞炎症因子和破骨分化因子的影响　　取新鲜拔除的恒牙，分离并培养原代人牙周膜成纤维细胞，鉴定细胞来源后取状态良好的第4～6代细胞用于实验。常规培养细胞并以浓度为400μMCORM-3预处理细胞6h，然后以浓度为1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激24h，用常规Trizol的方法提取细胞总RNA，应用实时定量PCR的方法从基因水平检测炎症环境下人牙周膜成纤维细胞COX-2、PGE2、OPG和RANKL的mRNA表达以及CORM-3的调控作用;同样在CORM-3预处理6h，然后以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁炎症诱导24h后，收集HPDLF细胞提取总蛋白，用蛋白印记实验方法在蛋白水平检测炎症环境下人牙周膜成纤维细胞COX-2、PGE2、OPG和RANKL的表达以及CORM-3的调控作用。用完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理人牙周膜成纤维细胞后再以浓度为1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁诱导致炎，观察CORM-3对COX-2、PGE2、OPG和RANKL表达的调控作用是否还存在，以确定CORM-3的抑炎作用是否由其活性成分CO介导。　　（二）CORM-3对人牙周膜成纤维细胞HO-1表达的影响　　取新鲜拔除的恒牙，分离并培养原代牙周膜成纤维细胞，鉴定细胞来源后取状态良好的第4～6代细胞用于实验。以浓度为400μM CORM-3预处理细胞6小时后，分别提取细胞总RNA和总蛋白，以实时定量PCR和蛋白印迹实验的方法，从mRNA和蛋白水平检测HO-1的表达。用完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理人牙周膜成纤维细胞6小时，分别提取细胞总RNA和总蛋白，以实时定量PCR和蛋白印迹实验的方法，从mRNA和蛋白水平检测HO-1的表达。探讨该作用是否由CORM-3的活性成分CO介导。　　常规培养细胞并以400μM的CORM-3预处理细胞6小时，以浓度为1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁诱导致炎，24小时后分别提取细胞总RNA和总蛋白，以实时定量PCR和蛋白印迹实验的方法，从mRNA和蛋白水平检测HO-1的表达。用完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理人牙周膜成纤维细胞6小时，以浓度为1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁诱导致炎，24小时后用上述方法检测HO-1的表达，以确定CORM增强HO-1表达作用是否由CO介导。　　（三）CORM-3抑制LPS和尼古丁诱导的人牙周膜成纤维细胞炎症因子及破骨细胞因子表达的机制　　取新鲜拔除的恒牙，分离并培养原代牙周膜成纤维细胞，鉴定细胞来源后取状态良好的第4～6代细胞用于实验。研究CORM-3的抑炎作用是否由机体细胞保护机制HO-1通路介导。采用LIP03000用瞬时转染的方法将HO-1基因沉默，以浓度为400μM的CORM-3预处理人牙周膜成纤维细胞6小时，以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激细胞24小时，分别提取RNA和总蛋白，以实时定量PCR和蛋白印迹法从基因和蛋白产物两方面检测HO-1、COX-2、PGE2、OPG和RANKL的表达，研究在缺失HO-1通路的介导作用后，CORM-3对炎症细胞因子和破骨分化相关因子的调控作用是否存在。　　结果：　　第一部分 CORM-3对人牙周膜成纤维细胞的毒性、增殖的影响以及抑制炎症环境下细胞凋亡的作用　　成功分离培养原代人牙周膜成纤维细胞，鉴定为中胚层来源。CCK-8检测结果浓度为0～400μM的CORM-3刺激人牙周膜成纤维细胞24小时后，细胞的数量以及形态与正常对照组比较无明显差异，检测细胞活性示与对照组无明显差异，提示该浓度范围的CORM-3对人牙周膜成纤维细胞无明显毒性，而800μM的CORM-3对人HPDLF细胞则有明显毒性。以0、100、200、400μM的CORM-3刺激HPDLF细胞，分别于0，24，48，72，96小时用CCK-8法检测细胞活性，结果显示浓度为400μM的CORM-3对HPDLF细胞有较明显的促增殖作用。1μg/ml的LPS和5mM尼古丁可促进HPDLF细胞的凋亡，以工作浓度400μM的CORM-3预处理后，则可抑制炎症刺激引起的细胞凋亡。　　第二部分 CORM-3对人牙周膜成纤维细胞炎性因子及破骨细胞因子表达的影响及其作用机制　　（一）CORM-3对LPS和尼古丁诱导下的人牙周膜成纤维细胞炎症反应的调控作用　　以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激细胞，炎性细胞因子COX-2、PGE2、RANKL的表达量较对照组均显著升高(P＜0.05)，且骨保护素OPG的表达受到明显抑制。以400μM CORM-3预处理细胞6小时，再以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激细胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表达较致炎组均显著降低(P＜0.05)，而OPG则有明显提高(P＜0.05)。而完全释放掉CO的失活的CORM-3则无明显抑炎作用。证明CORM-3有抑制LPS和尼古丁诱导的HPDLF细胞炎症的作用而且该作用是由CORM-3溶于液体后释放出的CO介导而不是由其底物。　　（二）CORM-3对人牙周膜成纤维细胞HO-1表达的影响　　单独以浓度为400μM CORM-3预处理细胞6小时后，HO-1的mRNA和蛋白表达较对照组比较有显著提高(P＜0.01);而完全释放掉CO的失活的CORM-3则无提高HO-1表达的作用，表明CORM-3有促进HPDLF细胞HO-1高表达的作用，而且该作用由CORM-3的活性成分CO介导的。　　以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激细胞，HO-1的表达较对照组有所升高(P＜0.05);以浓度为400μM的CORM-3预处理细胞6小时后，再以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激细胞，则HO-1的表达较对照组和致炎组均有显著升高(P＜0.01);而完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理细胞则无提高HO-1表达的作用。提示1μg/ml LPS+5mM尼古丁的伤害性刺激能提高HO-1的表达量，而以400μM CORM-3预刺激后再致炎，则有更显著的促进HO-1高表达的作用。　　(三)CORM-3对LPS和尼古丁诱导下的人牙周膜成纤维细胞的抑炎作用的机制　　采用瞬时转染的方法将HO-1基因沉默后，以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激细胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表达较对照组均显著升高(P＜0.05)，但骨保护素OPG的表达无明显改变;HO-1基因沉默后，以400μM CORM-3预处理细胞6小时，再以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激细胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表达较对照组显著升高(P＜0.05)，而且与致炎组比较无明显变化，虽OPG的表达无明显改变，但OPG/RANKL比值显著降低(P＜0.05)。结果显示在HO-1通路缺失的情况下，CORM-3抑制炎性因子及破骨细胞因子表达的作用消失，提示我们CORM-3对LPS和尼古丁诱导下的HPDLF细胞的抑炎作用是通过HO-1通路介导的。　　结论：　　1.400μM CORM-3对人牙周膜成纤维细胞无明显毒性，且有促进增殖作用，400μM CORM-3抑制IPS和尼古丁诱导的HPDLF细胞凋亡。　　2.400μM CORM-3抑制脂多糖和尼古丁刺激下人牙周膜成纤维细胞炎性因子及破骨细胞因子表达。　　3.400μM CORM-3能显著增强人牙周膜成纤维细胞HO-1的表达。　　4.CORM-3抑制脂多糖和尼古丁刺激下人牙周膜成纤维细胞炎性因子及破骨细胞因子的表达是通过HO-1通路介导的。