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目的:本研究采用慢病毒携带NT-3(neurotrophin-3)基因转染的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),探讨NT-3修饰BMSCs移植阿尔茨海默病脑内对认知功能和记忆力的影响,以及海马区神经功能修复及再生的影响。为进一步BMSCs基因治疗阿尔茨海默病提供技术和理论支持。方法:1.取SD大鼠股骨或胫骨骨髓间充质干细胞,经密度梯度离心法分离后进行体外培养,倒置显微镜下观察BMSCs形态及生长,通过传代纯化和扩增。取第三代BMSCs流式细胞术鉴定骨髓MSCs表面的抗体CD44、CD90、CD34和CD45表达。2.构建并制备大鼠NT-3过表达慢病毒及对照慢病毒,转染BMSCs细胞,48 h后,Western Blot检测NT-3表达情况。将NT-3过表达及干扰慢病毒转染的BMSCs细胞与乳鼠神经元细胞共培养,免疫荧光检测NSE表达情况。MTT检测共培养24 h、48 h、72 h细胞增殖情况;实时荧光定量PCR检测C/EBPβmRNA表达情况;Western Blot检测C/EBPβ蛋白表达情况。3.采用双侧海马注射Aβ1-42诱导AD大鼠模型,模型建立7d后,将PBS液、单一BMSCs、过表达NT-3的BMSCs、通过立体定向的方法注射到痴呆大鼠模型的双侧海马区,随机分成三组:PBS组、单一BMSCs组(BMSCs组)、过表达NT-3的BMSCs组(NT-3-BMSCs组),每组4只,1月后水迷宫实验检测AD大鼠在行为学改变。4.BMSCs移植1个月后,Western Blot测定大鼠海马组织中NT-3蛋白和C/EBPβ表达情况。检测BMSCs移植后海马中的神经发生,采用免疫荧光检测海马区βⅢ-tubulin表达情况。结果:1.利用密度梯度离心法得到纯度较高的骨髓间充质干细胞,细胞表面抗原检测显示大部分细胞CD44和CD90阳性,CD34和CD45阴性。2.慢病毒成功转染BMSCs,Western Blot显示BMSCs能长期稳定表达NT-3蛋白。MTT结果显示,与过表达对照组比较,48 h及72 h时间点NT-3过表达组BMSCs细胞增殖能力显著增强(P<0.05),与抑制对照组比较,48 h及72 h时间点NT-3沉默组BMSCs细胞增殖能力显著降低(P<0.05);荧光定量PCR及Western Blot结果表明C/EBPβm RNA及蛋白水平在NT-3过表达组BMSCs细胞中显著上调,而在NT-3沉默组BMSCs细胞中显著降低(P<0.05)。3.水迷宫检测移植NT-3修饰BMSCs或BMSCs移植治疗AD模型大鼠后,与PBS组相比各组大鼠认知和记忆能力有一定改善作用,NT-3-BMSCs组显著改善(P<0.05)。4.BMSCs移植1个月后Western Blot检测结果,与PBS组比较,NT-3-BMSCs组大鼠脑内海马组织NT-3水平明显升高(P<0.05),与PBS组相比,BMSCs组大鼠脑内海马组织中全蛋白中C/EBPβ的水平显著增加(P<0.05),NT-3-BMSCs组中进一步上调(P<0.05)。5.免疫荧光染色检测结果:与PBS组相比,BMSCs组和NT-3-BMSCs组海马组织中βⅢ-tubulin的表达升高,NT-3-BMSCs组显著升高。结论:1.NT-3可能通过促进C/EBPβ表达影响其下游相关靶基因的表达,促进BMSCs细胞向神经元分化,并提高细胞活力。2.经海马移植NT-3修饰的BMSCs或BMSCs可以提高AD大鼠学习记忆能力,NT-3的过表达促进AD大鼠海马区的神经元分化及神经再生,可能通过激活转录因子C/EBPβ亚型LAP来实现的。