目的心脑血管疾病一直以来困扰着人类的健康,而动脉粥样样硬化是其主要的病理基础,对动脉粥样硬化分子机制的深入研究,对心脑血管疾病的预防及治疗有着重要的意义。近年来有研究发现,氧化型LDL(oxLDL)参与了动脉粥样硬化的形成,而LDL的氧化过程需要低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的参与。低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)是一种内吞蛋白,属于低密度脂蛋白受体(LDLR)基因家族。低密度脂蛋白受体相关蛋白的伴侣蛋白即受体相关蛋白(receptorassociated protein,RAP)是一种常驻内质网蛋白,是LDLR家族的分子伴侣,对该家族受体由内质网向胞膜运输、正确折叠成熟及成熟过程中免受其他配体结合的攻击起至关重要的作用。RAP与LRP有高度的亲和性,当RAP与LRP结合时,能够阻止LRP与其它所有已知配体的结合/摄取。RAP已成为研究LDLR家族受体的良好工具。本实验旨在获得大鼠低密度脂蛋白受体相关蛋白的伴侣蛋白(LRPAPl)的基因克隆及表达载体的构建。为更好的了解LRP与LDL的氧化过程的关系,进一步探讨动脉粥样硬化与脂类代谢之间的关系提供一种有利的工具蛋白。方法利用大鼠肾上腺来源的Pc12细胞系,运用RT-PCR技术克隆RAP基因的cDNA全长片段,基因片段上游加上Kozak序列和酶切位点HindⅢ,下游加组氨酸标签蛋白序列和酶切位点XhoⅠ。以限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ将目的基因和表达质粒pcDNA3.1+切成粘性端,连接酶连接构建HisTag-LRPAPl融合蛋白的载体,转化感受态菌DH-5α,挑取阳性克隆,质粒提取试剂盒提取质粒,测序验证。结果经测序证实成功构建编码HisTag-LRPAPl融合蛋白的表达载体。讨论本实验从大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤Pc12细胞中,获得目的基因RAP的全长片段,将全长片段与表达质粒pcDNA3.1+连接,并进行扩增,提取出含有目的基因的质粒,为进一步的蛋白表达做好铺垫。本实验在引物设计时直接去除了目的基因5’端的信号肽序列,同时在上下游引物的两端加入了酶切位点5’HindⅢ和3’XhoⅠ,两端的酶切位点各加入3个保护碱基,确保了双酶切的效率及在插入质粒pcDNA3.1+时的方向性,对于下一步蛋白的正确表达打好基础。同时在引物设计时加入了6个组氨酸序列,为下一步蛋白的纯化做了保证。RAP作为多种脂蛋白受体的伴侣分子和配体,对研究受体的结构与功能具有重要作用,同时RAP也与某些疾病的发生有关,可应用于如膜性肾病、老年性痴呆等疾病的相关研究。本研究成功构建RAP,以此为基础可以表达RAP,进一步可以利用RAP来纯化LDLR家族的受体片段,为有关研究提供一种良好的工具。结论成功构建编码HisTag-LRPAPl融合蛋白的质粒载体,将来可用于真核表达此融合蛋白。