病毒性神经坏死病（Viral nervous necrosis,VNN）是由经坏死病毒（Nervous Necrosis Virus,NNV）感染引起的鱼类病毒性传染病,被国际兽疫组织（OIE）列为重要鱼类病害,我国将其列为二类疫病。VNN对仔鱼或幼鱼危害很大,尤其对石斑鱼养殖产业,种苗常在短时间内大量死亡,死亡率可达到95%以上,是我国石斑鱼养殖的瓶颈问题。由于仔鱼或幼鱼时期免疫系统尚不完善,疫苗防控存在局限。因此,药物防控VNN疫病成为石斑鱼等海水鱼种苗培育的有效手段。由于人用抗病毒原料药禁止在水产养殖中使用,渔业生产上的可用抗病毒药物寥寥无几。中草药具有绿色、环境友好、多种活性及不易产生耐药性等诸多优点,是天然的药源库。本研究通过体外细胞系筛选方法,对大黄、连翘等122种中草药提取物抗神经坏死病毒NNV活性进行了研究,并对优选的大黄中的主要活性成分大黄酸进行抗病毒活性评价及初步的抗病毒机制研究,以期为开发抗NNV特效药和渔药先导化合物提供理论依据。本研究取得结果如下:1.抗NNV中草药活性筛选将122种中草药粉碎至30-40目,首先采用石油醚超声回流提取,去除挥发油,再用无水甲醇提取,减压浓缩,浸膏、低温干燥获得中草药粗提物;NNV感染斜带石斑鱼鳍条细胞系（Epinephelus coioides Grouper fin cells,GF-1）后加入中草药粗提物进行抗NNV活性筛选,实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-q PCR）检测结果显示:大黄、丁香和鸡血藤等9种中草药对NNV的抑制率超过80%,其中大黄活性最佳,抑制率达到99.6%;对大黄中活性分子大黄酸和大黄素抗NNV活性研究结果显示:两者均能显著抑制NNV诱导的细胞病变,且其对NNV的50%抑制浓度(IC50)分别为8.78μM和8.62μM;NNV滴度检测结果显示:抗NNV活性更高的大黄酸显著降低了NNV滴度,证实了大黄酸成为抗NNV病毒活性分子的潜力。2.大黄酸离体抗NNV活性评价NNV感染GF-1细胞后,与大黄酸共孵育,采用Actin-Tracker Green、Hoechst荧光染料染色,荧光显微镜观察发现:大黄酸能够显著降低病毒诱导的GF-1核损伤和微丝结构重排;NNV感染GF-1细胞24 h后与大黄酸共孵育,RT-q PCR结果显示:大黄酸对NNV增殖的抑制率为81.1%,表明大黄酸对NNV感染具有良好的治疗效果;NNV和大黄酸在细胞外共孵育1、2、4 h后感染GF-1细胞,其对NNV增殖的抑制率分别为23.39%、25.54%、35.82%,证明大黄酸对NNV病毒粒子具有直接杀灭作用,杀灭效果表现出时间依赖性;在病毒感染GF-1细胞的单个复制周期（24 h）内进行添加大黄酸时间测定,RT-q PCR结果表明:大黄酸主要在NNV进入细胞后的6-8 h发挥作用从而抑制病毒增殖。3.大黄酸对NNV诱导的细胞周期阻滞和ATP合成调控研究NNV感染GF-1细胞后加入大黄酸,采用流式细胞仪、全自动酶标仪检测细胞周期变化、细胞内ATP水平,结果显示:大黄酸处理显著抑制NNV诱导的细胞周期S期阻滞,增加GF-1细胞系G2/M期细胞比例;NNV在感染GF-1细胞6 h、12 h显著升高细胞ATP水平,而加入大黄酸后显著降低了NNV诱导的ATP水平。此外,采用线粒体呼吸链复合物抑制剂以降低GF-1细胞ATP合成,并通过流式细胞术检测和RT-q PCR检测发现:NNV诱导的细胞周期S期阻滞和NNV的增殖均被抑制,表明降低宿主细胞ATP合成能有效改变NNV主导的细胞周期S期阻滞,从而抑制NNV增殖。总之,大黄酸在NNV复制前中期通过降低GF-1细胞的ATP合成,抑制NNV诱导的细胞周期S期阻滞,干扰病毒增殖。综上所述,从大黄中发现的活性分子大黄酸在体外具有良好的抗NNV活性,在病毒复制前中期通过降低宿主细胞ATP合成,抑制NNV诱导的细胞周期S期阻滞,从而干扰病毒增殖。本研究为抗NNV新型药物研发提供了理论依据,为大黄的产业化应用提供了研究基础。